《Animal Reproduction Science》：Supplementation of Baicalin (BC) in extender improves structural and functional characteristics, total antioxidant capacity and in vivo fertility of ram semen
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本研究评估Baicalin（BC）对绵羊精子冷冻保存后质量的影响，发现0.75μM BC显著提升精子运动能力、活性和膜完整性，并提高人工授精受精率至52.38%。
Morteza Jafaroghli | Hossein Abdi-Benemar | Behrooz Khalili | Jamal Seifdavati | Vahid Vahedi
伊朗德黑兰Payame Noor大学（PNU）农业系，邮政信箱19395-3697
摘要
本研究旨在评估黄芩素（Baicalin，简称BC）补充剂对公羊精液在冷却过程中的质量、解冻后的精子特性、氧化状态以及受精率的影响。研究人员使用人工阴道从四只生殖健康的公羊体内每周采集两次精液样本，共获得64份精液样本。这些精液样本被混合后按1:4的比例用Tris-柠檬酸-果糖-蛋黄稀释液（TCFY）进行稀释，并加入不同浓度的黄芩素（0.50、0.75或1 μM）。稀释后的样本被装入0.25 mL的吸管中，逐步冷却至5°C，持续90分钟，然后置于液氮蒸汽中冷冻保存。24小时后，在37°C的水浴中解冻30秒。结果表明，0.50和0.75 μM浓度的黄芩素显著改善了精液在冷却和冻融过程中的质量参数（P < 0.01），而1 μM浓度的黄芩素与对照组无显著差异。在0.75 μM浓度下，精子的前进运动能力（43.36 ± 1.54%）、存活率（56.14 ± 1.44%）和膜完整性（52.34 ± 1.22%）均达到最高水平。人工授精后的受精率从对照组的20.68%分别提高到0.50 μM和0.75 μM处理组的51.66%和52.38%。综上所述，向精液稀释剂中添加0.75 μM的黄芩素能有效提升公羊精液在解冻后的质量和受精能力。
引言
精子冷冻保存是动物科学中推动生殖技术发展的重要手段。近年来，这一技术的应用范围显著扩大，反映了人们对储存精液用于繁殖计划的日益依赖。精子冷冻过程中的主要挑战之一是精子容易受到损伤，尤其是氧化应激的损害。活性氧（ROS）是一种由细胞内部过程及外部环境因素和病理条件产生的高反应性分子，在这种损伤中起关键作用。维持ROS生成与抗氧化防御之间的平衡对于维持细胞正常生理功能至关重要（Wang等人，2025年；Zamani等人，2023年）。在冷冻过程中，这种平衡被打破会导致ROS过度积累，从而引发氧化应激，损害精子的DNA、蛋白质和膜结构，进而影响精子的存活率和功能（Kussler等人，2025年）。
精液浆液和精子细胞本身都含有抗氧化剂，可以自然地保护精子免受氧化应激的伤害。然而，细胞自身的抗氧化能力有限（Mokhtari等人，2024年）。在冷冻过程中，精液的稀释会降低精液浆液中的保护成分，进而增加精子细胞内的氧化应激（Cabrita等人，2011年）。因此，在冷冻保存方案中添加抗氧化剂是一种常见的方法，以减少ROS对精子的损害（Fleming和Thomson，2025年）。多项针对不同物种的研究表明，具有抗氧化和冷冻保护特性的添加剂能够改善精液质量，例如提高精子的运动能力、膜稳定性、内在抗氧化防御能力和受精潜力，从而减轻冷冻对精子的有害影响（Sapanidou等人，2023年；Abdi-Benemar等人，2020年；Büyükleblebici等人；Sapanidou等人，2016年、2014年；Bucak等人，2009年）。
天然抗氧化剂主要由酚类物质组成，它们分布于植物的各个部分。这些物质的抗氧化机制包括中和自由基、结合金属离子、抑制单线态氧以及作为还原剂（Avdatek等人，2024年）。黄芩素（BC）是一种从Scutellaria baicalensis根中提取的黄酮类化合物，属于Lamiaceae科（Pshenichkina，2022年）。除了其天然特性外，黄芩素还因其强大的抗氧化能力而受到关注，同时也在其他多种植物中存在。研究表明，黄芩素具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗菌、抗真菌和抗癌作用（Guo等人，2024年）。黄芩素能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性，从而减少ROS的生成（Zhao等人，2019年）。实验发现，黄芩素通过氧化还原敏感信号通路增强细胞存活率并维持线粒体完整性，包括稳定线粒体膜电位、抑制凋亡级联反应、促进ATP合成以及提高ADP的利用（Le等人，2005年；Zhang等人，2010年；Liu等人，2022年）。其抗氧化机制涉及上调内在防御系统（如超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX），同时下调脂质过氧化标志物（如丙二醛MDA）的水平（Carrera-Chávez等人，2020年；Zhao等人，2019年）。尽管黄芩素在神经生物学和药物治疗领域已有广泛研究，但其在兽医应用中的潜力，特别是在精子冷冻保存和繁殖生物技术中的扩展剂成分方面的作用仍需进一步探讨。
最新研究表明，植物来源的抗氧化剂在保存精子结构和功能完整性方面具有重要作用（Lopes-Ferreira等人，2025年）。然而，关于黄芩素作为公羊精液稀释剂添加剂的有效性的全面数据仍然不足。因此，本研究旨在评估黄芩素补充剂对公羊精子物理和功能特性的影响，通过测量TAC来检测氧化状态的变化，并确定人工授精后的受精情况。研究结果有望为黄芩素作为功能性添加剂在精液保存技术和提高绵羊繁殖成功率方面的应用提供新的见解。
动物和精液采集
本研究在伊朗Jafar-Abad的Moghani绵羊育种站进行（坐标：北纬39° 26’ 20.6”，东经48° 5’ 26.4”），时间跨度为5月至6月。所有动物操作均遵循Payame Noor大学研究伦理委员会的批准协议。实验对象为年龄在3至4岁之间的成熟公羊，它们均采用标准化饲养方案以确保实验结果的均匀性。精液样本每周采集两次。
结果
表1总结了公羊精液特征的初步评估结果。表2、表3和表4详细展示了不同浓度黄芩素（添加到TCFY稀释液中）对精液运动能力、前进运动能力、存活率、顶体形态缺陷、总体异常情况以及膜完整性（通过低渗肿胀试验检测）在稀释、冷却和解冻后的影响。稀释后立即添加不同浓度的黄芩素并未对精子特性产生显著影响。
讨论
公羊精液的冷冻保存技术与其他反刍动物的冷冻保存技术基本一致。然而，解冻后的公羊精子存在一些独特的脆弱性和反应特点，例如易受冷冲击、细胞内冰晶形成、氧化损伤、与冷冻保护剂相关的毒性、渗透压应力以及精子膜脂质和蛋白质的变化（Watson和Martin，1975年）。
结论
总之，本研究表明，0.75 μM浓度的黄芩素作为精液稀释剂中的有益添加剂，能够改善解冻后精子的功能参数并提高受精率。此外，0.75 μM浓度的黄芩素还能增强精子的抗氧化防御能力，并有效降低脂质过氧化程度，表现为稀释剂中MDA浓度的下降。更多大规模样本的研究以及对分子机制的深入探讨将有助于我们更全面地了解黄芩素的作用机制。
未引用的参考文献
(Büyükleblebici等人，2014年；Hammerstedt，1993年；Lee等人，2005年；Weitze，1977年)
作者贡献声明
Morteza Jafaroghli：撰写、审稿与编辑、数据可视化、项目管理和概念构思。
Behrooz Khalili：监督工作、软件开发、项目管理和概念构思。
Hossein Abdi-Benemar：监督工作、资源调配、项目管理和资金争取、概念构思。
Vahid Vahedi：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化及验证。
Jamal Seifdavati：方法设计、实验实施、数据分析。
利益冲突声明
作者声明本研究未涉及任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。
致谢
本研究得到了Ardabil Payame Noor大学（项目编号：0102/1838）的财政支持。作者衷心感谢Ardabil农业组织及Jafar-Abad的Moghani绵羊育种站的工作人员提供的宝贵帮助，尤其是工程师A. Sarvi和Mardaneh在整个研究过程中的协作。
