《Infection and Immunity》：Acquisition of toxin-encoding lysogenic bacteriophage elements enhances the virulence of pandemic Streptococcus pyogenes M1UK
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本研究揭示了新出现的化脓性链球菌（Group A Streptococcus, GAS）M1UK亚型通过获得编码超抗原和DNA酶的原噬菌体元件或发生covS突变，进一步增强其毒力的分子机制。通过体外实验和体内人源化超抗原敏感小鼠皮肤感染模型，研究证实这些遗传改变导致更强的T细胞激活和更严重的感染病理，为理解M1UK在全球的扩张和致病性增强提供了关键证据。
ABSTRACT
多个国家观察到猩红热病例惊人地增加，这些病例通常与一种新的化脓性链球菌亚型，即M1UK相关。M1UK菌株表达更高水平的链球菌热原性外毒素A（SpeA）超抗原。本研究比较了该亚型与流行的M1global菌株的毒力特征。研究人员获得了当代加拿大的M1UK分离株，基因组测序显示，一些M1UK菌株获得了额外的编码DNA酶和超抗原的原噬菌体元件，还有一个分离株存在covS基因突变。选择了五种化脓性链球菌菌株进行功能实验，包括5448（M1global菌株）、M1UK350（“典型”M1UK菌株）、M1UK162（含有covS基因突变的M1UK菌株）、M1UK362ΦSP1380.vir（含有编码spd1、speC和ssa基因的原噬菌体元件的M1UK菌株）和M1UK155Φ370.1（含有编码spd1和speC基因的原噬菌体元件的M1UK菌株）。外蛋白谱分析表明，所有M1UK背景菌株的SpeA超抗原产量均高于化脓性链球菌5448。此外，获得了额外原噬菌体元件的菌株显示出增强的人T细胞激活能力，尽管细胞毒性活性、粘附能力和DNA降解能力没有检测到差异。使用“人源化”的超抗原敏感HLA转基因小鼠感染模型，与5448和M1UK350相比，M1UK162 covS突变株、M1UK362ΦSP1380.vir和M1UK155Φ370.1菌株在实验性皮肤感染期间均表现出严重程度增加。这些发现表明，流行的M1UK背景菌株持续获得额外的原噬菌体编码毒力因子或高毒力covS突变，这些遗传改变可能导致人类感染严重性的增加。
INTRODUCTION
化脓性链球菌（通常称为A组链球菌）是一种人类限制性细菌病原体，可引起咽炎和脓疱病等常见感染，包括坏死性筋膜炎和肌炎在内的侵袭性感染，以及毒素介导的疾病猩红热和链球菌中毒性休克综合征。此外，反复感染导致的感染后后遗症可引发自身免疫性风湿性心脏病。虽然化脓性链球菌主要存在于无症状携带状态，但侵袭性化脓性链球菌感染和风湿性心脏病的并发症导致了相当高的人类死亡率，每年至少有约50万人死亡。
化脓性链球菌根据M蛋白基因5'端的变异性进行血清分型。在20世纪80年代中期，emm1基因型（现在通常称为“M1global”）成为高收入国家侵袭性感染中最常分离到的M型之一，其出现归因于获得了编码链球菌热原性外毒素A（SpeA）超抗原和DNA酶Sda1的原噬菌体，以及导致链球菌溶血素O操纵子表达增加的遗传重组事件。最近，全球感染增加是由一个称为M1UK的emm1亚型的出现引起的，该亚型与M1global菌株相比具有27个核心基因组单核苷酸多态性（SNP），并且SpeA表达量增加了约10倍。SpeA表达的增加可追溯至ssrA基因上游的一个单核苷酸多态性，导致下游speA转录增加。SpeA被认为是参与链球菌中毒性休克综合征的关键化脓性链球菌毒力因子，尽管这种超抗原也能促进实验性上呼吸道感染，并且还能在人类复发性扁桃体炎期间诱导免疫球蛋白产生抑制。因此，增强的SpeA表达不仅有助于侵袭性感染的严重程度，也可能与携带和传播的适应性优势有关。
化脓性链球菌M1UK的显著扩张及其对经典流行菌株的替代，需要采用多学科方法来理解和控制这一重要的公共卫生问题。本研究利用体外实验和体内人源化超抗原敏感小鼠皮肤感染模型，对四种加拿大M1UK菌株与经过充分研究的化脓性链球菌5448 M1global菌株进行了表型特征比较。这四种M1UK菌株包括一个“典型”M1UK菌株、一个在组氨酸激酶传感器covS（毒力控制）基因中具有失活突变的菌株，以及另外两个通过获得溶原性噬菌体元件而获得额外毒力因子的分离株。研究结果表明，当代化脓性链球菌M1UK分离株持续进化以获得额外的噬菌体编码毒力特征，这可能有助于增强侵袭性化脓性链球菌感染的严重性。
RESULTS
M1UK分离株的基因型和毒素表达差异
为了表征和比较加拿大化脓性链球菌M1UK临床分离株的遗传和致病特征，研究人员获得了全基因组序列并与参考菌株MGAS5005的基因组进行了比对。研究人员鉴定出三个临床分离株（M1UK155、M1UK350和M1UK362），每个都含有M1UK菌株中描述的27个特征性SNP，包括负责增强SpeA生产的ssrA 5'区域内的变异。从初步评估上清液谱的实验中也检测到一个具有明显毒力控制（cov）突变表型的分离株（M1UK162），随后证实其covS基因内存在Leu238→Phe238突变。除了特征性的M1UKSNP外，在整个基因组中还观察到其他缺失和SNP，突出了细菌样本之间的额外遗传变异性。对每个菌株中存在的毒力因子进行计算机分析揭示了一个相对一致的遗传模式；然而，被鉴定为M1UK362和M1UK155的两个菌株由于获得了噬菌体ΦSP1380.vir（编码spd1、speC和ssa）或Φ370.1（编码spd1和speC）而表现出额外的毒力因子谱。为清晰起见，后面这两种M1UK菌株分别称为M1UK362ΦSP1380.vir和M1UK155Φ370.1。因此，为了确认计算机观察到的差异，通过PCR证实了毒力因子基因speA、speC、ssa、spd1、speB和slo的存在。此外，在用丝裂霉素C进行噬菌体诱导方案后，研究人员能够在M1UK362ΦSP1380.vir分离株的上清液中检测到ΦSP1380.vir噬菌体的存在。
为了表征这些菌株的分泌蛋白表达模式，收集细菌上清液并通过SDS-PAGE和Western免疫印迹进行评估。从上清液蛋白谱来看，M1UK162菌株与其他分离株显著不同，这与covS失活突变以及SpeB半胱氨酸蛋白酶表达的缺失和SLO的过表达一致。重要的是，每个M1UK分离株都显示出SpeA超抗原的特征性过表达，这与M1UK菌株相对于5448观察到的ssrA上游SNP一致。除了M1UK162 covS突变株，每个菌株都产生与5448相似的SpeB蛋白酶。正如从获得额外噬菌体所预测的那样，在M1UK362ΦSP1380.vir和M1UK155Φ370.1分离株中检测到超抗原SpeC的表达，而SSA仅在M1UK362ΦSP1380.vir中可检测到产生。这些结果表明，M1UK分离株由于鉴定出额外的SNP而继续表现出遗传变异性，而且还可以获得表达额外毒力因子的噬菌体元件。
化脓性链球菌M1UK分离株的表型特征
鉴于M1UK162菌株存在covS突变和改变的分泌蛋白谱，使用基于琼脂平板的酪蛋白蛋白水解试验评估了所有M1UK菌株的蛋白水解活性。正如预测的那样，化脓性链球菌M1UK162的蛋白水解活性与其他菌株相比急剧降低，这通过该分离株周围没有抑制区来证明，而其他分离株（包括5448）的蛋白水解活性相似。研究人员还使用底特律-562鼻咽细胞进行了粘附试验和细胞毒性试验，但与M1global化脓性链球菌5448相比，两种试验均未检测到差异。除了超抗原，ΦSP1380.vir和Φ370.1噬菌体都编码一种额外的DNA酶。首先通过分析不同浓度的细菌上清液对来自speC扩增产物的PCR产物的作用来测定DNA酶活性。在未稀释和100倍稀释的上清液中观察到相似的DNA降解模式。接下来，评估了培养上清液对中性粒细胞胞外陷阱（NET）的降解作用，作为DNA酶活性的进一步衡量指标。从健康人类供体中分离出多形核细胞，并用PMA刺激以诱导NETs的形成。在与化脓性链球菌上清液孵育后，观察到核染色减少以及所有评估的化脓性链球菌菌株对NETs的完全降解。为了量化这些观察结果，测量了相对荧光强度。用M1UK上清液刺激的样品显示出与用化脓性链球菌5448刺激的样品相似的平均荧光强度。在M1UK350中，观察到可检测到的荧光升高。
M1UK谱系中超抗原SpeA的过表达是这些新兴化脓性链球菌菌株的一个表型特征。接下来，研究人员使用从人外周血单核细胞（PBMC）产生IL-2来量化分离株上清液激活T细胞的能力。虽然5448与M1UK350和M1UK162分离株之间没有明显差异，但研究人员发现，用化脓性链球菌M1UK362ΦSP1380.vir和M1UK155Φ370.1的上清液刺激后，IL-2产量显著增加。该试验中的统计分析是通过比较每组IL-2产生的最高峰值（稀释度10?2）进行的，因为浓度更高的上清液对PBMC具有细胞毒性，这可能是由于细胞溶解毒素所致。这些数据表明，除了化脓性链球菌M1UK162 covS突变株外，不同的M1UK菌株具有与化脓性链球菌5448相似的表型特征，尽管有两个M1UK分离株获得了与增强的T细胞激活反应相关的额外溶原性原噬菌体元件。
实验性皮肤感染中M1UK菌株的特征
为了评估不同M1血清型菌株之间的毒力特征，使用皮肤感染模型对表达人类MHC II类（MHC-II）分子的转基因小鼠进行攻击。超抗原直接与TCR和MHC-II分子作为宿主受体结合；然而，链球菌超抗原与大多数小鼠MHC-II分子的结合亲和力较弱，而表达人类MHC-II的小鼠允许链球菌超抗原在体内发挥作用。从这些实验中，化脓性链球菌5448和M1UK350菌株表现出相似的皮肤感染特征，小鼠体重没有减轻，病变大小相似，72小时时的CFU相当。然而，与5448菌株相比，化脓性链球菌M1UK162、M1UK362ΦSP1380.vir和M1UK155Φ370.1在感染后72小时内体重均显著下降。此外，由M1UK162、M1UK362ΦSP1380.vir和M1UK155Φ370引起的病变大小在感染后72小时明显更大。视觉上，感染化脓性链球菌5448或M1UK350的小鼠显示出炎症较轻的病变，其特征是浸润较少且没有皮肤坏死性病变。感染M1UK155Φ370.1的小鼠在72小时时每个病变的细菌负荷也显著增加。最后，为了评估皮下皮肤感染M1global或M1UK菌株后的全身炎症反应，使用细胞因子阵列来量化感染后72小时血清中的细胞因子和趋化因子。感染M1UK350的小鼠显示出IFNγ和IL-2升高的趋势，而感染M1UK162的小鼠与假手术组和M1global感染的小鼠相比，显示出嗜酸粒细胞趋化因子、IL-12p40、M-CSF、MIG和TNFα升高的趋势。此外，感染M1UK362ΦSP1380.vir菌株导致G-CSF和KC产量增加，而M1UK155Φ370.1诱导IL-6、IL-17、IP-10、MCP-1和MIP-1β数量升高。总之，研究人员在涉及含有covS突变或额外噬菌体的M1UK菌株的感染中观察到促炎分子升高的趋势。
DISCUSSION
化脓性链球菌拥有几种毒性和组织损伤毒力因子，包括细胞溶解毒素、蛋白酶、超抗原和DNA酶，而通过水平基因获得编码外毒素的噬菌体可以在细菌进化和生产更具致病性菌株方面发挥重要作用。此外，化脓性链球菌的高毒力菌株可以通过毒力控制（Cov）双组分系统的突变出现，这显著改变了全局基因调控，增强了多种毒力因子的表达。自从最初报道出现称为化脓性链球菌M1UK的M1血清型亚型以来，多个国家发现由这种emm1变体引起的侵袭性病例显著增加，包括加拿大。最近，国家iGAS监测计划报告称，M1UK在加拿大大幅扩张，从2022年的48.5%增加到2023年的60.3%。为了帮助理解导致化脓性链球菌M1UK扩张的因素，本研究旨在利用体外和体内特征，将一系列当代化脓性链球菌M1UK分离株与化脓性链球菌5448 M1global菌株进行比较，从而关联基因型与表型。研究结果表明，M1UK分离株持续进化，获得额外的噬菌体编码毒力因子，从而导致疾病加剧。
经典流行的M1菌株与M1UK亚型之间的一个关键表型差异是超抗原SpeA的过表达。SpeA历来被认为是猩红热和链球菌中毒性休克综合征的重要原因，尽管这些疾病表现可能无法解释化脓性链球菌M1UK的扩张。细菌超抗原通过结合T细胞受体β链和MHC-II分子的侧面来发挥作用，从而促进T细胞依赖性炎症反应。然而，表征超抗原在体内的功能具有挑战性，因为大多数小鼠MHC-II分子不能被细菌超抗原有效识别，因此常规小鼠对这些外毒素的影响相对不敏感。为了克服这一限制，多项研究使用转基因了人类MHC-II分子的“人源化”小鼠来评估超抗原在体内的作用。从迄今为止使用急性侵袭性或皮肤感染模型以及人类MHC-II转基因小鼠模型进行的实验来看，集体数据表明链球菌超抗原有助于疾病严重程度，但在侵袭性感染模型中似乎无助于化脓性链球菌的存活。然而，超抗原如SpeA可以促进局部鼻咽感染，这为M1UK谱系在多个国家扩张提供了一个合理的机制。
正如预期的那样，每个加拿大M1UK分离株都产生了更高水平的SpeA。然而，当比较化脓性链球菌5448 M1global菌株与化脓性链球菌M1UK350时，研究人员没有检测到任何其他显著的体内表型差异，这表明增强的SpeA产生对实验性皮肤感染没有贡献。研究人员还评估了M1UK162分离株，因为该菌株在CovS组氨酸激酶内含有Leu238→Phe238（L238F）突变。CovRS（也称为CsrRS）是一个经过充分表征的多效双组分调节系统，可以直接或间接调节化脓性链球菌基因组中约15%的基因。与先前对含有该双组分系统失活突变的菌株的研究一致，M1UK162具有显著改变的外蛋白谱，未产生可检测水平的SpeB半胱氨酸蛋白酶，但过量产生SLO毒素。Cov突变体也会过量产生SpeA，从Western免疫印迹实验来看，M1UK162确实似乎比其他M1UK分离株产生更高水平的SpeA。由于SpeA相对不易被SpeB蛋白酶降解，SpeA水平升高在逻辑上反映了通过covS突变对speA转录的去抑制以及来自ssrA启动子的转录通读增加。最近，一个含有covS突变的澳大利亚M1UK分离株被表征为仅具有细微的毒力因子变化，没有明显的SpeB表达变化。这进一步增加了化脓性链球菌中CovRS双组分系统的复杂性以及对M1菌株进行表型特征分析的重要性。
含有ΦSP1380.vir噬菌体（M1UK362）或Φ370.1噬菌体（M1UK155）的菌株，与化脓性链球菌5448或M1UK350相比，每个都诱导了更强效的人T细胞激活，这完全符合这些分离株编码和产生额外超抗原的能力。使用这些分离株进行皮肤感染也导致更大的皮肤病变，并在皮肤感染后引起小鼠显著的病理生理变化。此外，M1UK162菌株在皮肤感染模型中诱导了与具有额外毒力因子菌株相似的炎症反应。然而，尽管M1UK350和M1UK162相对于5448菌株产生的SpeA水平明显更高，但这些菌株的上清液并未导致人T细胞产生更多的IL-2，而获得额外超抗原编码噬菌体的两个分离株却显示了增强的IL-2产生。由于超抗原极其强效并以Vβ限制性方式激活T细胞，研究人员推测这些结果表明，即使SpeA产量较少的菌株，SpeA靶向的T细胞也已完全激活，而SpeC和/或SSA的产生（来自M1UK362ΦSP1380.vir或M1UK155）将靶向不同的T细胞亚群，导致IL-2水平升高。“经典”的M1UK350菌株显示出比其他M1UK组更高的IFN-γ和IL-2产量，尽管细菌负荷较低。这可能是由具有增强超抗原活性的菌株诱导的短期T细胞耗竭或无能来解释，导致在该时间点体内细胞因子产生减少。然而，不应过度解读细胞因子和趋化因子反应，因为这些血清样本是在实验终点收集的，因此可能至少部分反映了细菌负荷的差异，以及噬菌体获得性毒力因子的影响或covS突变的存在。与原噬菌体含有菌株在蛋白酶或DNA酶活性、细胞粘附或细胞毒性方面没有增强改变相一致，这些数据强烈表明增强的皮肤感染与额外噬菌体编码超抗原的产生有关。最后，含有失活covRS突变的化脓性链球菌菌株被认为是高毒力的，但在上呼吸道感染期间会被选择 against，然而皮肤感染在M1UK162
