《Infection and Immunity》：Elevated vaginal heparan sulfate correlates with impaired neutrophil killing of Candida albicans in women with vulvovaginal candidiasis
ABSTRACT
复发性外阴阴道念珠菌病（RVVC）是一种主要由机会性真菌病原体白色念珠菌引起的常见感染，影响着全球大量女性。尽管在多形核中性粒细胞（PMN）具有强效抗真菌特性的情况下，症状发作期间会出现强烈的炎症反应，但真菌清除常常失败，导致持续过度生长和PMN相关的免疫病理损伤。在已建立的动物模型中的研究表明，阴道硫酸乙酰肝素（HS）水平升高会干扰PMN与白色念珠菌的相互作用，从而损害真菌清除。本研究调查了诊断为RVVC的女性体内HS的存在及其抑制作用。
阴道条件培养基（VCM）由从有症状的VVC患者、无症状缓解期女性和健康对照者的拭子样本制备。ELISA和免疫染色结果显示，与无症状和健康对照组相比，有症状女性的VCM所含阴道分泌物和上皮细胞中的HS水平显著升高。PMN杀伤试验进一步揭示，与无症状和健康对照VCM相比，在有症状女性的VCM存在下，抗真菌活性显著降低，导致阴道HS浓度与PMN抗真菌活性之间呈显著负相关。HS的抑制作用在体外通过向对照VCM中添加纯化HS导致PMN杀伤功能受损，以及通过用乙酰肝素酶（HS裂解酶）处理有症状VCM和HS添加的对照样本后PMN功能得到恢复，而得到进一步证实。这些发现支持了动物研究的结果，并提供了首个临床证据，表明阴道环境中升高的HS导致PMN功能障碍，进而引起持续的白色念珠菌定植和VVC相关的免疫病理。
INTRODUCTION
外阴阴道念珠菌病（VVC）是一种常见的阴道感染，主要由机会性真菌病原体白色念珠菌引起。大约75%的女性在其一生中至少经历一次VVC发作，另有5%–8%的女性患有复发性VVC（RVVC），定义为每年发作三次或更多。VVC的已知风险因素包括雌激素水平升高、频繁使用抗生素和未控制的糖尿病。然而，大多数RVVC病例是特发性的，没有可识别的诱发因素，并且通常需要维持性抗真菌治疗。VVC和RVVC都以特征性症状为特点，包括瘙痒、红斑、灼痛和异常分泌物，严重影响着全球其他方面健康女性的生活质量。
对局部和全身适应性免疫的广泛研究已证明其在VVC中没有保护作用。相反，来自临床研究和动物模型的越来越多的证据强调了先天免疫机制的核心作用，特别是阴道上皮细胞和多形核中性粒细胞（PMN）在驱动VVC病理中的作用。值得注意的是，一项在女性中进行的人体挑战研究表明，在急性VVC发作期间，阴道腔中PMN的存在与症状严重程度密切相关。随后在小鼠中的研究表明，白色念珠菌菌丝激活阴道上皮，以及其溶细胞毒素（如念珠菌溶素）造成的损伤，启动了炎症信号传导，导致促炎介质（包括IL-1β和S100A8）的释放。这引发了PMN大量迁移至阴道腔，与念珠菌菌丝的过度生长一起，最终导致了特征性的VVC症状和相关组织损伤。
尽管PMN具有强大的抗菌特性，但迁移的PMN未能减少阴道环境中的真菌负荷，反而加剧了炎症并进一步导致持续的组织损伤。因此，VVC/RVVC主要是原本具有保护功能的PMN反应产生免疫病理结果所致。这在比较使用两种不同小鼠品系（抗VVC的远交系CD-1小鼠和易感VVC的近交系C3H小鼠（以及其他几种如C57BL/6）的研究中得到了例证，揭示了不同的结果。接种后，抗性CD-1小鼠通过有效的PMN抗真菌活性（包括中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成）有效清除了感染。这通过利用由CD-1小鼠天然阴道分泌物组成的阴道条件培养基（VCM）进行的体外PMN杀伤试验得到了证实。相反，易感C3H小鼠表现出持续的定植和炎症，同时阴道分泌物中硫酸乙酰肝素（HS）水平升高，这似乎在C3H VCM存在下介导了PMN功能障碍。实际上，一系列体外机制实验证明，纯化的HS抑制了CD-1 VCM中的PMN抗真菌杀伤，而乙酰肝素酶（HPSE，一种HS特异性裂解酶）恢复了C3H VCM中的PMN抗真菌活性。总的来说，这些结果表明HS作为PMN上Mac-1的竞争性抑制剂，阻止了其与白色念珠菌上pH调节抗原Pra1的相互作用，导致PMN介导的杀伤功能受损。然而，迄今为止，HS的这种抑制作用尚未在临床上进行研究。
HS是一种硫酸化糖胺聚糖，普遍存在于各种组织和分泌物中，包括阴道上皮和细胞外基质。人和小鼠的HS已被报道能够结合多种蛋白质，具有发挥抑制和激活作用的潜力。类似地，HPSE在局部和全身广泛表达，其酶活性已被证明在组织重塑、炎症和细胞迁移过程中调节HS的降解。鉴于先前的小鼠数据，我们假设在症状性VVC/RVVC期间，升高的阴道HS损害了PMN介导的真菌清除，而HPSE处理可以逆转这种损害。因此，本研究的目的 是调查HS在患有症状性VVC/RVVC的女性中损害PMN抗真菌活性的存在和参与情况。
MATERIALS AND METHODS
Subjects and enrollment
年龄在21至55岁之间被诊断为VVC/RVVC的女性于2021年9月至2023年3月期间在韦恩州立大学（WSU）传染病阴道炎诊所招募。共有42名符合年龄和诊断标准的患者在门诊就诊时入组，无论是因VVC/RVVC急性发作还是RVVC的维持治疗。其中，30名女性患有活动性VVC，经盆腔检查、即时显微镜检查、白色念珠菌培养阳性结果以及采样时存在一种或多种VVC相关症状（红斑、水肿、灼痛/触痛/酸痛、瘙痒、表皮脱落、异常分泌物、异味）确认（有症状组）。其余12名女性在RVVC缓解期入组，培养结果无论阳性或阴性，但采样时无症状（无症状组）。每组各有一名受试者因标本运输问题被排除在研究之外。此外，五名受试者（包括三名有症状和两名无症状女性）在随访时被重新招募，并收集了额外样本。其中两名受试者在复查时从有症状状态转为无症状状态。累计共有29名有症状和13名无症状受试者被纳入后续实验和数据分析。
在匹配年龄范围内无VVC病史的健康女性（n=16）于2021年8月至2023年4月期间在路易斯安那州立大学（LSU）健康新奥尔良分校的临床和转化研究诊所招募入组。
Specimen collection and processing
从每位受试者收集一套两个阴道拭子样本并合并。加上额外的5份随访样本，包括2例过渡性病例，总共获得了31份有症状和14份无症状拭子样本。WSU的VVC/RVVC患者的拭子样本由医生在盆腔检查期间收集。在LSU健康新奥尔良分校入组的对照女性在临床医生指导下自行进行拭子采样。在两种情况下，均使用无菌泡沫头涂抹器（Puritan）进行阴道拭子采样，将其插入阴道腔中部深度，轻轻旋转10-15秒。采样后，将拭子头从杆上取下，立即放入含有1 mL RPMI 1640培养基（GIBCO）、补充有1%青霉素-链霉素（Invitrogen）和蛋白酶抑制剂（Pierce）的15 mL锥形管中。使用第二个拭子重复此过程。涡旋振荡将拭子内容物释放到培养基中后，取等分试样进行处理，用于湿片显微镜检查以检测菌丝、培养以量化阴道真菌负荷以及如下所述的菌种鉴定。剩余溶液在1,000 × g离心5分钟，上清液经过无菌过滤并作为阴道条件培养基（VCM）在-80°C储存。细胞沉淀重悬于冷冻保存培养基（50%胎牛血清，30% RPMI，20%二甲基亚砜）中，并在-80°C储存。
Vaginal fungal burden and Candida speciation
为了量化阴道真菌负荷，将阴道拭子悬液的等分试样进行系列稀释，并在添加了庆大霉素（10 μg/mL, Invitrogen）的沙氏葡萄糖琼脂（SDA, BD Diagnostics）上培养。在37°C培养24小时后计数菌落形成单位（CFUs）。为了确定念珠菌种类，将额外的等分试样铺在CHROMagar念珠菌（CHROMagar）平板上，并在37°C培养48小时。
Microorganism culture
白色念珠菌SC5314作为甘油保存在-80°C。实验前，取一环保存液涂布在SDA平板上，于37°C培养24小时。挑取单个菌落转移到10 mL酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤（BD Diagnostics）中，在30°C、200 rpm振荡培养18小时。静止期白色念珠菌细胞用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）在1,000 × g离心5分钟洗涤三次，并使用血球计数器计数。
PMN and serum isolation
为了分离PMN，从健康志愿者身上采集10 mL全血至肝素钠真空采血管（BD）中，与等体积的5%葡聚糖（溶于0.9% NaCl）混合，室温静置20分钟使红细胞沉降。将富含白细胞的血浆层铺在6 mL Ficoll-Paque Plus（密度1.077 g/mL, GE Healthcare）上，以400 × g离心30分钟。将所得的中性粒细胞-红细胞沉淀用Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤两次，并重悬于冰预冷的0.1% NaCl中30秒，通过低渗裂解去除剩余的红细胞。用HBSS洗涤后，将富含中性粒细胞的沉淀重悬于50%人血清（溶于RPMI）中，并置于冰上直至使用。通过台盼蓝染料排斥法确认富集群中PMN存活率>95%，并使用血球计数器计数。为了分离血清，将10 mL全血在血清真空采血管（BD）中室温凝血1小时，然后以1,000 × g离心10分钟。血清分装后在-80°C储存直至使用。
VCM
VCM由通过0.45μm孔径注射器过滤器过滤的阴道拭子上清液组成。等分试样在-80°C储存直至使用。
ELISA for HS
使用夹心法人类HS ELISA试剂盒（Biomatik）按照制造商说明测量VCM样品中的HS浓度。样品进行稀释（1:4至1:2000）以落在标准曲线范围内。使用Synergy微孔板读数仪（BioTek）在450 nm波长下读取吸光度。
Lactate dehydrogenase assay (LDH)
使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定法（Promega）按照制造商说明测量VCM中LDH的释放水平。样品进行稀释（1:2至1:10）测试。在Synergy微孔板读数仪上于490 nm波长读取吸光度。LDH活性值表示为490 nm的光密度（OD490）。
Immunofluorescence staining
将阴道拭子悬液的细胞部分（1 × 104个上皮细胞/样品）使用Cytospin 4细胞离心机（Thermo）以1000 rpm离心5分钟，离心涂片到多聚赖氨酸包被的载玻片（Epredia）上。在冰预冷丙酮中固定5分钟后，载玻片在PBS中再水化，用封闭缓冲液（1%牛血清白蛋白溶于PBS）处理15分钟，然后与生物素化的抗HS抗体（克隆F-58 10E4, 5 μg/mL, AMSBIO）在4°C孵育过夜。洗涤载玻片后，用链霉亲和素-Alexa Fluor 488（绿色, Invitrogen）染色30分钟，并用Hoechst 33258（蓝色, 1 μg/mL, Thermo）染色15分钟，然后用Vectashield抗淬灭封片剂（Vector Laboratories）封片。使用Olympus FV-1000共聚焦显微镜和FluoView软件观察细胞。为了量化上皮细胞HS表达，使用ImageJ软件分析获取的荧光图像，测量上皮细胞的细胞面积、积分光密度和平均灰度值。每个细胞的校正总细胞荧光（CTCF）计算如下：CTCF = 积分光密度 - （所选细胞面积 × 平均背景荧光读数）。
PMN-C. albicans cocultures and killing assay
使用体外PMN-白色念珠菌共培养试验评估PMN抗真菌活性。计数PMN并用RPMI 1640培养基调整至1 × 106/mL，以每孔100 μL的体积转移到96孔板中。将板在37°C、5% CO2下预孵育30分钟以获得单层。白色念珠菌芽生孢子在使用前用5%人血清在室温下调理30分钟。初始孵育后，PMN单层（1 × 105/孔）接种白色念珠菌（1 × 104/孔），悬浮于100 μL RPMI 1640培养基或VCM样品中，在37°C、5% CO2下培养3小时。对照孔包括白色念珠菌在各自培养基中单独培养。共培养孵育后，用100 μL裂解缓冲液（0.05% Triton X-100溶于无菌水）裂解PMN，然后用100 μL新鲜裂解缓冲液洗涤孔板，并用移液器吸头刮取和吸弃。通过在SDA平板上培养24小时（35°C）后计数CFU来评估存活的白色念珠菌数量。杀伤百分比通过与在各自培养基中单独培养的白色念珠菌比较来确定，计算公式如下：% 杀伤 = [1 ? （PMN-白色念珠菌共培养的CFU / 白色念珠菌单独培养的CFU）] × 100。结果表示为% 杀伤 ± 平均标准误（SEM）。
HS spiking and HPSE treatment of VCM
为了测试HS的抑制作用，在共培养前向对照（非抑制性）VCM中添加纯化的HS（500 μg/mL，来源于猪肠，AMSBIO）。为了降解HS，将（抑制性）有症状VCM用重组人HPSE（rhHPSE, 4 μg/mL, R&D Systems）或重组Pedobacter heparinus肝素酶III（rPhHPSE, 3 ng/mL, R&D Systems）在37°C预处理1小时。处理后的VCM样品立即用于PMN杀伤试验。对照包括白色念珠菌在添加了HS或经HPSE处理的VCM中单独培养，并用于如上所述计算杀伤百分比。
Statistics
每位受试者的VCM和阴道上皮细胞样本均单独检查并纳入统计分析。对于HS添加和HPSE消化试验，将每组内两到三名受试者的VCM样本合并。每个数据集首先使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验。多组比较使用单因素方差分析（ANOVA，参数检验）或Kruskal-Wallis检验（非参数检验），然后进行适当的事后分析，比较特定组别，如图例所示。使用Pearson积矩相关系数评估HS浓度与%杀伤值之间的关系，以确定线性回归（R2）。显著性差异定义为P < 0.05的置信水平。所有数据均使用Prism软件（GraphPad）进行绘图和分析。
RESULTS
Demographic characteristics and VVC/RVVC status of study participants
所有参与者在采样前完成了一份人口统计学和妇科调查问卷，包括年龄、种族、抗真菌或激素治疗的使用、阴道症状的存在以及VVC发作史。在有症状女性（n = 29）中，所有人都正在经历活动性感染，具有经盆腔检查和实验室测试确认的VVC临床体征和症状。阴道粘膜红斑是VVC（n = 11, 68.8%）和RVVC（n = 11, 84.6%）亚组中最常报告的阴道炎表现，其次是分泌物、瘙痒、灼痛/发红/酸痛和水肿。每种症状的发生频率相似，范围大约在43%到68%之间。无症状组（n = 13）的女性在先前诊断的VVC/RVVC的缓解期入组。这些女性中的一部分（n = 5, 38.5%）尽管采样时无症状，但显示出可检测到的念珠菌定植。所有无VVC病史的对照受试者均未显示可检测到的念珠菌定植。在所有组中，激素避孕药、HRT或当前怀孕的使用很少报道，频率范围大约在6%到25%之间。
Relative vaginal pathology in symptomatic VVC and asymptomatic remission
为了验证临床体征和症状、白色念珠菌负荷与阴道组织损伤之间的关联，初步进行了真菌负荷和LDH释放（作为组织损伤的标志物）的比较评估。正如预期，除一份在随访访问中获得的样本外，有症状组的所有样本均含有显著升高的真菌负荷，与无症状组和对照组相比。相反，只有一小部分无症状组表现出低至中等水平的真菌定植。所有分离株均被鉴定为白色念珠菌。值得注意的是，在大多数有症状病例（n = 24, 77.4%）的显微镜检查中，白色念珠菌主要以菌丝形式存在，而在所有无症状样本中均未发现菌丝，尽管在某些情况下培养呈阳性。类似地，有症状组上清液中的LDH水平显著高于无症状组和对照组。此外，少数对照样本的LDH水平与有症状样本相当，尽管没有检测到真菌定植。
HS is significantly elevated during symptomatic VVC/RVVC episodes
先前在小鼠模型中的研究表明，阴道HS可以作为PMN Mac-1受体的竞争性类似物，从而抑制Mac-1与其在白色念珠菌上的配体Pra1的结合，损害PMN介导的真菌识别和杀伤。基于此，假设升高的HS在女性中类似地导致真菌清除受损。为了在临床上验证这一点，使用两种互补方法评估了阴道拭子样本中的HS水平。首先，通过ELISA测量VCM中分泌的HS浓度显示，有症状组（中位数Mdn = 36.7 [范围8.2–102.3] ng/mL）的HS浓度显著高于无症状组（Mdn = 8.1 [2.1–38.3] ng/mL）和对照组（Mdn = 12.2 [3.1–27.5] ng/mL）。其次，免疫荧光染色显示对照组上皮细胞中的HS表达极微，无症状组呈中度局灶性染色，而有症状组的HS表达显著升高，表现为强烈的胞质染色。有症状组的细胞还表现出形态异常，其特征是细胞膜破裂以及失去了对照组健康脱落上皮细胞典型的平滑、完整的细胞表面。为了验证染色结果，对上皮细胞绿色荧光强度的定量分析证实，有症状组和无症状组的HS表达均显著高于对照组，并且有症状组的水平显著高于无症状组。
PMN antifungal activity is inhibited under symptomatic VVC conditions
