《Journal of Bacteriology》：Defining the role of Pseudomonas aeruginosa PilY1 in signaling and virulence
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本研究深入探讨了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）IV型菌毛（T4P）尖端黏附素PilY1在信号传导和致病机制中的关键作用。文章揭示PilY1通过抑制AlgZ/R双组分系统的活性，进而负向调控主要腺苷酸环化酶cyaB（影响cAMP水平）和假定c-di-GMP磷酸二酯酶PA4781的表达，从而精细平衡第二信使cAMP和c-di-GMP的稳态。该信号通路在多种菌株（包括黏液型菌株）中保守，并在急性肺炎模型中显示出复杂的毒力表型。这项工作拓展了对AlgZ/R调节子及其在病原体适应环境中作用的理解，为干预铜绿假单胞菌感染提供了新的潜在靶点。
铜绿假单胞菌PilY1在信号传导与毒力中的作用界定
摘要
铜绿假单胞菌（Pa）是一种重要的机会性病原体，其通过协调表达多种毒力因子引起感染。PilY1蛋白是IV型菌毛（T4P）的组成部分，但在菌毛之外还具有额外的信号传导功能。PilY1的一个主要功能是阻止AlgZ/R双组分系统发挥作用。然而，PilY1通过控制AlgZ/R或其他调控系统进行信号传导的完整效应尚不完全清楚。本研究确定了受AlgZ/R系统控制并被PilY1影响的新基因。我们发现PilY1通过阻止AlgZ/R系统激活主要腺苷酸环化酶cyaB来影响cAMP水平。PilY1还阻止AlgZ/R系统激活自身以及一个假定的c-di-GMP磷酸二酯酶PA4781。此外，PilY1在不同的铜绿假单胞菌菌株（包括黏液型菌株）中均发挥功能。出乎意料的是，细菌在肺、肝和血液中的存活并不需要PilY1。总体而言，这些发现表明PilY1对于阻止AlgZ/R活性以防止不当的第二信使产生至关重要。这项工作确定了新的AlgZ/R靶点，并揭示了AlgZ/R系统在控制铜绿假单胞菌cAMP水平中的作用。
引言
铜绿假单胞菌是一种人类机会性病原体，能够在免疫功能低下个体中引起致命感染。在疾病过程中，粘附宿主组织是定植的先决条件，而IV型菌毛（T4P）在粘附中起主导作用。T4P的一个组成部分PilY1，在T4P之外还具有额外作用。最近的工作发现，当细菌遇到表面时，PilY1在信号传导中也很重要。了解这些初始事件期间发生的分子事件可以为开发新的治疗方式以对抗铜绿假单胞菌感染提供信息。
T4P由主要菌毛蛋白亚基PilA和次要菌毛蛋白FimU-PilVWXE组成。PilY1是T4P的尖端黏附素，在抽搐运动、粘附和机械感应中发挥作用。转录调节因子Vfr和AlgZ/R双组分系统控制fimU操纵子的表达，该操纵子是一个多顺反子操纵子，编码pilY1。AlgZ/R系统由膜组氨酸激酶AlgZ和反应调节因子AlgR组成，它们激活众多基因的转录。一旦产生，PilY1会阻止AlgZ/R系统的激活，从而形成负反馈环。fimU操纵子是已知的唯一受PilY1影响的AlgZ/R靶点。由于AlgZ/R系统控制着许多基因，我们假设PilY1通过AlgZ/R系统影响除fimU操纵子（包含pilY1）之外的其他基因，但这尚未得到研究。
PilY1也被发现存在于内膜以及细胞外作为菌毛的一部分，这表明PilY1在T4P之外具有功能。事实上，另一项研究发现PilY1在控制非运动菌株的次级代谢产物、细胞密度和持久性方面很重要。这项研究发现PilY1在慢性感染铜绿假单胞菌菌株中仍然具有功能。因此，PilY1可能在急性和慢性感染中都很重要。然而，PilY1信号在不同菌株中是否相似尚未确定。
PilY1信号影响第二信使，其中一个已知的调控c-di-GMP的机制是：PilY1感应表面，上调c-di-GMP水平以增加生物膜形成。相比之下，有研究表明PilY1在表面结合后对于上调cAMP很重要。然而，PilY1如何控制cAMP的机制尚不清楚。其他研究表明cAMP和c-di-GMP呈负相关，因此PilY1如何影响两者尚未阐明。如果PilY1增加cAMP水平，那么这可以解释pilY1突变体在各种发病模型中毒力降低的原因。转录激活因子Vfr结合cAMP导致几种毒力因子的产生增加。PilY1参与cAMP的过程尚未被仔细研究，这将极大地增进我们对各种调控系统相互作用的理解。
虽然PilY1对信号传导很重要，但其下游影响的全部范围尚不清楚。利用RNAseq和其他遗传及生化方法，我们鉴定了PilY1信号级联中的其他靶点。
材料与方法
本研究使用了铜绿假单胞菌PAO1等多种菌株和质粒。通过同源重组、转录融合报告基因分析、RNA测序（RNAseq）、蛋白质印迹、电泳迁移率变动分析（EMSA）、位点定向诱变、表型测定（如绿脓菌素测定和生物膜测定）以及小鼠急性肺炎竞争实验等方法进行研究。动物实验方案经东田纳西州立大学机构动物护理和使用委员会批准。
结果
PilY1以不同于其他菌毛组分的方式影响cAMP水平
机械感应的一个后果是环二鸟苷酸（c-di-GMP）的增加。值得注意的是，cAMP水平会抑制铜绿假单胞菌中的c-di-GMP水平。这使我们推测PilY1可能影响铜绿假单胞菌中的cAMP水平，这可以解释pilY1突变体中c-di-GMP的降低。我们构建了cdrA（c-di-GMP传感器）和lacP1（cAMP传感器）的转录lux报告基因来实时监测第二信使的水平。结果表明，?pilY1菌株的cdrA报告基因活性显著降低，而lacP1报告基因活性适度增加。互补实验证实了PilY1的作用。与其他菌毛组分（如?pilA和?pilJ）突变体的比较显示，PilY1对cAMP和c-di-GMP的影响方式不同，表明其功能独特。
转录组学分析揭示受pilY1突变影响的基因
RNAseq分析比较了?pilY1突变体与野生型PAO1菌株的基因表达。共发现168个基因在?pilY1中上调，118个基因下调。下调基因包括与绿脓菌素生物合成、I型分泌系统和VI型分泌系统（H2-T6SS）相关的基因。值得注意的是，IVb型菌毛（tad locus和flp）的表达也严重降低。上调基因包括fimU操纵子（包含pilY1本身）、algZ、主要腺苷酸环化酶cyaB和假定的c-di-GMP磷酸二酯酶PA4781。这些结果提示了PilY1调控cAMP和c-di-GMP水平的潜在新机制。
主要腺苷酸环化酶cyaB在?pilY1菌株中表达增加
RNAseq数据显示cyaB在?pilY1突变体中表达增加。我们构建了cyaB-lux和cyaB-lacZ转录报告基因进行验证，证实了?pilY1中cyaB表达显著上调。互补实验表明，PilY1的表达可以恢复cyaB的表达水平。对其他cAMP相关基因（cyaA和cpdA）的报告基因分析表明，PilY1主要特异性影响cyaB。
AlgZ/R负责pilY1突变体中cAMP水平的增加
为了探究cyaB上调的调控机制，我们测试了Vfr和AlgZ/R系统的作用。将编码磷酸化缺陷型AlgR（AlgRD54A）的等位基因引入?pilY1背景（?pilY1 RD54A）后，cyaB报告基因的活性显著降低，而与?vfr突变无关。这表明磷酸化的AlgR是cyaB表达增加所必需的。过表达algZ/R操纵子也能增加cyaB报告基因活性。EMSA和位点定向诱变证实AlgR直接结合到cyaB启动子上特定的AlgR结合位点（ consensus: CCGTTNNTC），并证明该位点对于AlgR介导的激活至关重要。因此，AlgZ/R系统通过直接调控cyaB来影响cAMP水平，而PilY1的作用是阻止AlgZ/R对cyaB的激活。
PilY1在多种菌株类型中发挥作用，包括黏液型菌株
为了评估PilY1功能在不同遗传背景下的保守性，我们在实验室菌株PAO1、PA103以及临床菌株383及其黏液型衍生物2192（mucA突变体）、PAO1的黏液型衍生物PDO300中进行了研究。使用fimU-lacZ报告基因（已知受AlgZ/R正调控和PilY1负反馈调控）进行评估。在所有测试的菌株中，删除pilY1均导致fimU报告基因活性显著增加。同样，cyaB-lacZ报告基因在所有这些菌株的?pilY1突变体中也显示活性增加。这表明PilY1通过抑制AlgZ/R系统来调控基因表达的功能在多种菌株（包括慢性感染相关的黏液型菌株）中是保守的。
PilY1影响algZ/R表达
RNAseq数据显示?pilY1中algZ表达增加，提示algZ/R操纵子可能存在自我调控。我们构建了分别针对algZ启动子（控制整个操纵子）和algR启动子（位于algZ编码区内，仅控制algR）的转录报告基因。结果显示，?pilY1中控制algZ的启动子活性显著增加，而控制algR的启动子活性没有变化。将磷酸化缺陷型algRD54A等位基因引入?pilY1背景后，algZ报告基因活性恢复至野生型水平。蛋白质印迹分析证实?pilY1菌株中AlgR蛋白水平增加，而在?pilY1 RD54A菌株中降低。EMSA实验证明纯化的AlgR能够直接结合到algZ启动子区域。这些结果表明AlgR（ likely 磷酸化形式）能够直接激活其自身操纵子的表达（正自动调控），而PilY1通过抑制AlgZ/R活性来阻止这种自动调控。
PilY1通过阻止AlgR磷酸化影响PA4781表达
RNAseq显示假定的c-di-GMP磷酸二酯酶基因PA4781在?pilY1中表达上调。我们构建了PA4781-lux报告基因进行验证，证实其表达在?pilY1中增加，并可被PilY1互补所恢复。遗传分析表明，这种上调依赖于AlgR的磷酸化（因为?pilY1 RD54A中活性降低），而与Vfr无关。EMSA实验证明AlgR能够直接结合到PA4781启动子区域。因此，PilY1通过抑制AlgZ/R系统的活性来阻止PA4781的表达上调。
PilY1在急性肺炎模型中不贡献于适应度
先前研究提示pilY1突变体毒力减弱。我们在急性肺炎小鼠模型中进行了竞争实验，将标记的野生型PAO1与?pilY1突变体以1:1比例混合后，通过口咽吸入感染小鼠。16小时后，分析肺、肝、脾和血液中的细菌载量并计算竞争指数（CI）。出乎意料的是，?pilY1突变体在肺（CI = 1.63）和血液（CI = 5.9）中比野生型更具竞争力（CI > 1），在肝和脾中与野生型竞争力相当（CI ≈ 1）。作为对照，?pilA突变体在肺、肝和脾中均表现出明显的竞争劣势（CI < 1）。这表明在急性肺炎模型中，PilY1对于细菌在这些组织中的存活并非必需，甚至在某些情况下突变体更具竞争力，而IV型菌毛的结构蛋白PilA则对毒力至关重要。
讨论
本研究确立了PilY1在控制铜绿假单胞菌第二信使cAMP和c-di-GMP平衡中的核心作用，其机制是通过抑制AlgZ/R双组分系统的活性。我们发现了新的AlgZ/R调节子成员：主要腺苷酸环化酶cyaB、假定的c-di-GMP磷酸二酯酶PA4781以及algZ/R操纵子本身（正自动调控）。这些发现揭示了PilY1-AlgZ/R信号轴在精细调控第二信使稳态中的关键地位，这种调控在多种菌株背景（包括慢性感染相关的黏液型菌株）中保守。
关于毒力表型，本研究的竞争实验表明，在急性肺炎模型中，PilY1的缺失并不导致毒力减弱，反而在肺和血液中显示出竞争优势。这与之前一些基于其他感染模型的研究结果不同，提示PilY1在感染过程中的作用可能具有情境依赖性。相比之下，菌毛结构蛋白PilA的缺失则明确导致毒力减弱，强调了完整T4P结构在感染初期的重要性。
我们提出一个模型：在浮游状态或接触表面前，AlgZ/R系统和Vfr共同激活fimU操纵子（包含pilY1）的表达。产生的PilY1蛋白则反馈抑制AlgZ/R系统的活性，防止其不适当地激活cyaB（导致cAMP产生）和PA4781等靶基因，从而维持第二信使的基线水平。当菌毛接触表面后，其他菌毛组分（如PilJ）可能激活CyaB酶活，导致cAMP水平局部升高，进而激活Vfr并表达T3SS等毒力因子。此时，PilY1对AlgZ/R的抑制可能有助于解除AlgR对T3SS等毒力基因的潜在抑制，从而协调毒力表达。因此，PilY1作为AlgZ/R活性的“刹车”装置，对于确保第二信使和毒力因子在正确的时间和地点表达至关重要。
未来的研究需要进一步阐明PilY1分子本身如何感知环境信号并调控AlgZ/R活性。理解这一复杂的信号网络将为开发针对铜绿假单胞菌及其他抗生素耐药性细菌的新治疗策略提供有价值的见解。
致谢
本研究由R03 AI185654-01、RDC基金（大小额）以及生物医学健康科学系的资金支持。
