《Journal of Clinical Microbiology》：A tiled amplicon protocol for culture-free whole-genome sequencing of M. tuberculosis from clinical specimens
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本综述系统介绍了TB-seq技术——首个针对细菌病原体（结核分枝杆菌）的瓦片式扩增子测序方案。该技术通过5128个引物实现4.4 Mb基因组的全覆盖，无需培养即可直接从痰液样本中获得近完整基因组数据，将药敏检测时间从数周缩短至数天。研究证实其能准确鉴定分枝杆菌谱系和耐药突变（包括MDR/XDR-TB），为结核病（TB）的精准诊疗和公共卫生监测提供了突破性工具。技术成本仅19.07美元/样本，适用于资源有限地区，有望推动全球结核病基因组流行病学研究。
ABSTRACT
全基因组测序（WGS）作为结核病监测和治疗的重要工具，能揭示传播规律并提供全面的药物敏感性检测。然而，结核分枝杆菌缓慢的生长特性导致传统培养测序需耗时数周，限制了该技术的临床推广应用。瓦片式扩增子测序作为一种快速、可靠且经济的WGS方法，可直接对临床样本进行检测，已在全球学术和公共卫生实验室大规模应用，曾是SARS-CoV-2测序的基石技术并成功推广至多种病毒病原体。但针对更大基因组的细菌病原体，类似技术尚属空白。本研究设计了包含5128个引物的扩增子panel，覆盖结核分枝杆菌全基因组，是迄今最大的瓦片式扩增子测序方案。应用该方案对痰液样本进行检测，证明无需培养即可获得细菌全基因组序列，数据可用于鉴定结核分枝杆菌谱系和可靠识别耐药标记物。该技术有望将药敏检测时间从数周缩短至数天，推动基因组流行病学在资源有限地区的规模化应用。
INTRODUCTION
结核病是全球单一感染源致死的首要原因，年死亡人数超百万。COVID-19大流行导致2020-2023年间额外增加约70万结核病死亡病例，全球病例数持续上升。疫情期间，病毒全基因组测序在毒株分型和传播追踪方面取得显著进展，为疾病控制提供实时支持。将类似技术应用于结核病防控具有重要价值：WGS可精确重建传播网络、识别超级传播者、区分复发与再感染，并在国家层面刻画传播动态。更重要的是，WGS能全面检测耐药基因突变（涉及450个SNP），为个体化治疗方案提供依据。尽管英国、意大利和美国已将结核分枝杆菌WGS纳入国家监测体系，但高成本、长周期（需先进行长达6周培养）以及培养过程中可能导致的菌群多样性丢失等问题，限制了其在低收入国家的推广。现有快速药敏检测方法（如NAATs和LPAs）虽能在1-2天内得出结果，但覆盖位点有限，无法满足复杂耐药检测需求。WHO仍推荐对疑似广泛耐药结核（XDR-TB）样本进行表型药敏验证。瓦片式扩增子测序技术凭借其低成本、高灵敏度和易操作性，在病毒基因组监测中展现出巨大潜力，将其拓展至细菌病原体有望实现低样本量、无培养的快速测序。
RESULTS
瓦片式扩增子测序实现临床样本直接全基因组回收
TB-seq panel包含2564对引物，通过两池2 kb扩增子覆盖4.4 Mb结核分枝杆菌基因组。对摩尔多瓦培养分离株和秘鲁痰液样本的测试表明，扩增测序在100 GE/μL浓度下即可实现>95%基因组覆盖，而非扩增方法需要104GE/μL。针对10份优化提取的痰液样本，9/10的扩增样本覆盖率超过75%（7份>95%），且能有效排除口腔共生菌（如Schaalia odontolytica）干扰。该方案成本仅为19.07美元/样本，具有显著经济优势。
直接痰液测序支持谱系鉴定与耐药标记检测
通过Mykrobe软件对高覆盖率（>75%）样本进行谱系分析，所有样本均成功归属至谱系2.2.1或4。最大似然系统发育树验证了分型准确性。耐药预测显示，在≥10 GE/μL的样本中，TB-seq对15种抗结核药物的预测与表型药敏结果高度一致（42/47）。虽然链霉素耐药相关基因rpsL覆盖度较低导致部分 discordance，但技术对异质性耐药也表现出检测能力。对60份痰液样本的测试中，53份可生成可靠耐药预测，包括至少1例MDR-TB样本。
计算机模拟验证扩增子方案对大型细菌基因组的适用性
对比结核分枝杆菌（闭锁基因组）和肺炎链球菌（开放基因组）的扩增子覆盖效果发现，结核分枝杆菌在不同谱系中均保持高覆盖度（≥89.44%），而肺炎链球菌在不同GPSC谱系间覆盖度差异显著（32.18%~88%）。这源于结核分枝杆菌较高的基因组保守性（平均核苷酸一致性99.27%~99.98%）和较小的泛基因组（基因总数/平均基因组大小=1.07）。研究表明扩增子技术更适用于基因组重组率低的胞内病原体。
DISCUSSION
TB-seq首次将瓦片式扩增子测序成功应用于细菌病原体，实现痰液样本直接、快速的WGS检测。该技术显著缩短检测周期，避免培养引入的偏差，并能同步获得谱系信息和耐药突变数据。对于结核病这一重新成为最致命单一病原体的疾病，TB-seq有望在新型疫苗评估、个体化治疗和传播干预中发挥关键作用。尽管在涂阴样本中的应用仍需验证，但其在涂阳样本中的优异表现（覆盖度>75%）支持其在公共卫生监测中的立即部署。该技术采用与SARS-CoV-2测序相同的流程，全球数千个实验室可快速转化应用。印度、孟加拉国等国已具备相关技术基础，未来结合纳米孔测序等便携平台，将进一步推动高负担地区的结核病基因组 surveillance。若成功应用于临床，TB-seq将通过精准药敏指导和传播阻断，为结核病防控带来变革性进步。
MATERIALS AND METHODS
TB-seq引物设计基于489株全球代表性结核分枝杆菌基因组，以H37Rv为参考基因组，通过PrimalScheme设计2 kb扩增子，硬掩蔽PE/PPE区域和已知耐药位点。临床样本包括摩尔多瓦培养分离株和秘鲁痰液样本，采用五种DNA提取方法优化流程。通过结核分枝杆菌复合群特异性qPCR进行定量，使用Illumina COVIDSeq试剂盒构建文库，替换为TB-seq引物池。数据分析采用BWA-MEM比对、Mykrobe分型及耐药预测，离靶扩增通过Bowtie比对评估。
