《Microbiology Spectrum》：Sensitive detection and differentiation of rhinoviruses and enteroviruses by a nested real-time RT-PCR assay
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本研究报告开发了一种基于SYBR Green的巢式实时逆转录PCR（RT-PCR）检测方法，通过精心设计的特异性引物，成功实现了对鼻病毒（RVs）和肠道病毒（EVs）的高灵敏度鉴别诊断。该方法解决了传统检测（如FilmArray Respiratory Panel 2.1）无法区分RVs与EVs的难题，并首次揭示了临床样本中RV/EV双重感染的存在，为呼吸道病原体的精准诊断和流行病学监测提供了有力工具。
ABSTRACT
鼻病毒（RVs）和肠道病毒（EVs）是重要的呼吸道病原体。尽管已经开发了许多用于检测RVs和EVs的分子检测方法，但它们的遗传相似性给分子鉴别带来了挑战。本研究描述了一种使用SYBR green以及RV和EV特异性反向引物的实时巢式逆转录（RT）-PCR检测方法，用于差异检测RVs和EVs。引物经过设计，使得错配的数量和位置对于目标病毒最为合适，而对于相反的病毒最不合适，设计时利用了GenBank中所有的EV和RV序列。该检测方法使用来自庆应义塾大学医院2021年11月至2023年1月期间出现发热和/或呼吸道症状的儿科患者的鼻咽拭子标本进行了验证，这些标本经FilmArray Respiratory Panel 2.1检测为人鼻病毒/肠道病毒阳性。通过使用BLAST程序分析PCR产物的序列来确定物种和血清型。本RT-PCR检测方法与BLAST分析的结果完全一致。此外，当前检测方法揭示了RV和EV双重感染的病例。在不同病毒物种之间，患者人口统计学特征或临床病程未观察到显著差异。本文介绍的检测方法可能最适合于RV和EV感染的常规诊断和监测。
IMPORTANCE
我们描述了一种实时巢式逆转录-PCR检测方法，使我们能够差异检测鼻病毒和肠道病毒。由于鼻病毒和肠道病毒的遗传多样性和相似性，对其感染的鉴别诊断一直未能成功。我们通过使用基于GenBank获得的所有鼻病毒和肠道病毒序列进行计算机分析而设计的特异性PCR引物解决了这个问题。所开发的方法通过应用于日本庆应义塾大学医院儿科患者的100多份鼻咽拭子标本并使用BLAST算法进行分析得到了验证。该检测方法可能适用于鼻病毒和肠道病毒感染的常规诊断和监测。
INTRODUCTION
鼻病毒（RVs）是呼吸道感染最常见的病原体，其临床表现包括中耳炎、哮吼、细支气管炎和肺炎，并会加重潜在的慢性肺部疾病，如儿童哮喘。RVs是无包膜、正义单链RNA病毒，属于小RNA病毒科的肠道病毒属。肠道病毒属包括12个肠道病毒物种，以及三个鼻病毒物种。目前有84种鼻病毒A血清型、30种B血清型和56种C血清型。肠道病毒（EVs）在婴幼儿中引起多种疾病，包括手足口病、脑炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、结膜炎以及呼吸道和胃肠道疾病。某些疾病与特定的EV血清型相关：肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16引起手足口病，肠道病毒D68引起呼吸道疾病和急性弛缓性脊髓炎。有报道称肠道病毒D68在呼吸道分子诊断平台上与RVs存在交叉反应。
许多分子检测方法已被开发用于检测RVs和EVs，例如逆转录PCR、巢式PCR、实时RT-PCR、基于核酸序列的扩增以及最近的RT环介导等温扩增、RT链入侵基于扩增和RT重组酶聚合酶扩增。这些检测方法大多靶向5‘非编码区，该区域在RVs和EVs中具有高度保守的序列。由于这些病毒存在广泛的分子变异性和交叉相似性，区分RVs和EVs需要额外的步骤，包括电泳、探针杂交、限制性内切酶消化、测序以及使用锁核酸探针。然而，据我们所知，这些检测方法尚未被证明能成功区分所有RV和EV原型株。
2019年冠状病毒病大流行开始后，基于多重PCR的检测，如FilmArray Respiratory Panel 2.1，在日本临床环境中更频繁地用于呼吸道感染检测。自2020年10月起，庆应义塾大学医院除了实施一般感染控制措施外，还在儿科病房推行FilmArray Respiratory Panel 2.1，以防止COVID-19的输入和聚集。然而，该检测板的一个缺陷是无法区分RVs和EVs。
在本研究中，我们开发了一种巢式实时PCR检测方法，使用基于GenBank数据库计算机设计的PCR引物来区分RVs和EVs。该检测方法通过比较对COVID-19大流行期间疑似呼吸道感染儿科患者样本进行FilmArray Respiratory Panel 2.1检测的结果进行了评估。
MATERIALS AND METHODS
研究设计
研究对象为年龄在20岁以下、有发热和/或呼吸道症状、并接受了FilmArray Respiratory Panel 2.1检测的患者。从2021年11月到2023年1月，收集鼻咽拭子样本并用FilmArray进行检测，将人鼻病毒/肠道病毒阳性样本用于本RT-巢式PCR检测。标本在-80°C下保存直至检测。
数据收集
收集的信息包括FilmArray结果、我们的鼻病毒/肠道病毒PCR结果、患者年龄、性别、潜在医疗问题、哮喘既往史、给氧、哮喘发作以及重症监护室入院情况。
RNA提取
使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit从200 μL鼻咽标本中提取总核酸，操作遵循制造商说明。
引物设计
为了选择引物，我们从GenBank获得了1,628条RV序列和5,329条EV序列，这些序列均具有全长病毒基因组，并使用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11在5‘非编码区和VP4区对它们进行了比对。然后，计算每个候选引物与其对应区域病毒序列之间在5’非编码区和VP4区域全长的未匹配核苷酸数量，并选择对RVs和/或EVs最具特异性的序列。候选引物的选择标准如下：熔解温度尽可能接近58°C；引物序列自身不互补或一对引物之间不互补；如果合适，允许在少于三个位置掺入简并核苷酸。通过这种方式，选择了对RVs和/或EVs最具特异性的序列。最后，确认特异性引物的序列与属于小RNA病毒科但不属于肠道病毒属的人类宿主病毒序列没有显著同源性。由此获得的引物如表1所示。
巢式RT-PCR和测序
第一轮RT-PCR用于扩增RVs和EVs的DNA，反应体系为20μL，包含引物ERV1-F和ERV1-R各0.2 μM、4 mM MgCl2、每种dNTP各0.2 mM、0.04 μL RNasin Ribonuclease Inhibitor、0.04 μL SuperScript III Reverse Transcriptase、0.08 μL Platinum Taq DNA Polymerase、2 μL 10× PCR buffer for Platinum Taq以及4 μL提取的样本，使用GeneAmp PCR System 9700进行。热循环程序包括：56°C 10分钟，94°C 2分钟，然后进行30个三步循环，每个循环为94°C 5秒，64°C 10秒，72°C 15秒，最后72°C 1分钟，并于4°C保存。第二轮PCR使用2 μL第一轮PCR产物，通过CFX Connect Real-Time PCR System进行，使用引物ERV2-F和RV-2R检测RV的DNA，或使用引物REV2-F和EV2-RA/B检测EV的DNA。第二轮PCR的条件与第一轮RT-PCR相同，但包含0.16 μL 1000×稀释的Lonza SYBR Green I，不含核糖核酸酶抑制剂和逆转录酶，且热循环次数为25次而非30次。如果荧光曲线呈指数增长并超过默认阈值，则样本被视为阳性。使用QIAquick PCR Purification Kit提取第二轮PCR产物后，在Eurofins Genomics Inc.进行测序。
统计分析
患者特征以分类变量的频率和百分比、连续变量的中位数和四分位数范围进行汇总。比较鼻病毒类型时，分类变量使用Fisher精确检验，连续变量使用Mann-Whitney U检验。显著性水平设定为P < 0.05。统计分析使用R统计软件4.0.5版进行。
RESULTS
FilmArray结果
研究期间，共有365份鼻咽拭子样本接受了FilmArray Respiratory Panel 2.1检测。其中，230份样本呈阳性。在阳性样本中，139份为人鼻病毒/肠道病毒阳性。其中115份样本用于验证本RT-巢式PCR检测方法。其余15份样本因残留物太少而无法检测。FilmArray阳性样本的详细信息如表2所示。
引物设计
为了高灵敏度地检测鼻咽标本中的RVs和EVs，我们采用了实时RT-巢式PCR。我们的意图是设计第一轮PCR用于扩增所有属于RVs和EVs的病毒，第二轮PCR通过使用不同的引物组完全区分RVs和EVs。通过使用从GenBank下载的病毒序列搜索符合这些要求的引物。表3显示了每个选定引物与其对应区域在5,328个EVs和1,627个RVs中的错配频率。用于特异性扩增EVs和RVs的引物ERV1-F、ERV1-R和ERV2-F与EVs和RVs的对应序列高度匹配：在极少数情况下观察到>2个错配。另一方面，RV特异性反向引物RV2-R与5,324个EV序列和1个RV序列存在>2个错配；EV特异性反向引物EV2-R与3个EV序列和1,612个RV序列在全长引物序列中存在>2个错配。当比较引物3‘端五个核苷酸（这对PCR扩增有显著影响）的匹配情况时，这些引物的特异性变得更加明显。值得注意的是，引物RV2-R的3’端起第五个核苷酸被设置为胸腺嘧啶而非胞嘧啶，这是为了增加与EV序列的一个错配，代价是与RV序列增加一个错配。
临床标本检测
我们对115份经FilmArray检测为人鼻病毒/肠道病毒阳性的鼻咽拭子标本进行了PCR检测。结果显示，103份标本对RV特异性引物呈阳性，7份标本对EV特异性引物呈阳性，4份标本对RV特异性引物和EV特异性引物均呈阳性，1份标本对RV或EV引物均呈阴性。使用SYBR Green的实时PCR中，使用RV特异性引物或EV特异性引物的典型扩增曲线和熔解曲线如图1所示。RV和EV序列的扩增通过其扩增产物的熔解温度来区分。可以清楚地显示标本是RV阳性、EV阳性还是两者均阳性。
为了检验本检测方法的可靠性，我们通过BLAST分析第二轮PCR扩增产物的序列，鉴定了114份RV和/或EV阳性临床样本中的病毒物种和血清型。其中，103份经PCR显示为RV的样本包含RV A、B或C物种的序列；7份经PCR显示为EV的样本包含EV A或D物种的序列；4份经PCR显示为RV和EV均阳性的样本同时包含RV和EV物种。这些结果与当前PCR检测的结果完全一致。
临床关联
仅比较了RV A和RV C患者的特征和临床表现。两者之间没有显著差异。
DISCUSSION
本研究报告了一种使用SYBR Green的实时巢式RT-PCR检测方法，用于检测和区分RVs和EVs。已有一些研究报道了用于特异性检测RVs和EVs的实时PCR检测方法。然而，除了?sterback等人的研究外，这些研究并未成功区分RVs和EVs。他们使用了针对RVs和EVs的锁核酸探针来提高检测的特异性。他们的方法的局限性在于单轮PCR导致的灵敏度低以及探针可能与RVs和EVs发生交叉反应。
在COVID-19大流行期间，FilmArray Respiratory Panel 2.1在日本变得非常流行，因为它可以同时检测多种呼吸道病原体，包括SARS-CoV-2。在庆应义塾大学医院，自大流行以来，我们已常规使用该检测板对发热或有呼吸道症状的儿科患者进行检测。在使用FilmArray检测呼吸道感染的过程中，我们遇到了一些问题。其中之一是RVs和EVs不被区分，而是被诊断为“人鼻病毒/肠道病毒”。因此，无法获得RV或EV感染的精确诊断。这一缺陷可能使全国范围的监测和流行病学研究变得困难。另一个问题是无法检测到RV和EV的双重感染。相比之下，我们的检测方法没有这些问题。此外，它还可以通过对最终PCR产物进行测序和BLAST分析来确定RV和EV的基因型。
在我们的检测方法设计中，通过特异性引物的差异实现了RVs和EVs的区分。如表3所示，RV特异性引物RV2-R和EV特异性引物EV2-RA/B与从GenBank获得的RV和EV序列存在差异性的错配数量。PCR引物与模板之间错配的影响已被广泛研究。其中，Lefever等人研究了使用包含不同数量和位置错配的引物的影响。他们的结果表明，引物3‘末端的错配、引物3’末端最后五个核苷酸中有两个或更多错配、或者引物中有四个或更多错配会显著降低PCR扩增效率。当应用这些规则，结合引物序列和收集的完整病毒序列来预测检测结果时，在5,317个EVs中，有16个可能无法被检测到，有1个可能被误判为RV阳性；而所有1,627个RVs都将被检测并诊断为RV。尽管本研究涉及的EV阳性临床样本数量较少，但上述计算机分析表明，本检测方法将能够早期区分性地鉴定几乎所有EVs以及RVs。
在115份FilmArray阳性样本中，有1份样本通过我们的检测方法呈阴性。目前尚不清楚这是由于FilmArray的假阳性还是本检测方法的假阴性。有关FilmArray上扩增产物的核苷酸序列信息可能有助于阐明此类差异。
在本研究中，我们发现鼻病毒A和C是COVID-19大流行期间庆应义塾大学医院儿科患者中最常见的病原体。这一发现与先前的一份报告一致，该报告指出在日本新泻的新生儿和婴幼儿中，鼻病毒A和C在COVID-19大流行期间占了感染的大部分。需要进一步研究以观察这种趋势是否在COVID-19大流行结束后仍在持续。
本研究存在一些局限性。首先，虽然使用超过100份样本对检测方法进行了评估，但可能需要在更多样化的人群中进行更大规模的研究以进行验证。其次，未评估本方法的灵敏度，尽管由于两种检测方法的结果一致，预计其灵敏度与FilmArray相当。第三，巢式PCR技术的应用虽然能实现更高的灵敏度，但操作可能比较繁琐，且难以实现仪器自动化。
总之，我们开发了一种灵敏的方法，不仅能够区分RVs和EVs，还能检测它们的共感染。我们希望该系统能够进一步发展，并整合到同时检测其他呼吸道病原体的工具中，作为常规诊断和病毒监测的实时监控手段。
ACKNOWLEDGMENTS
我们感谢Shigefumi Higono和Yoshitomo Tani的财务支持。
