《Microbiology Spectrum》：A novel parvovirus circulating in canine populations and sporadically detected in human oropharyngeal samples
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本研究发现并鉴定了一种新型犬相关细小病毒（HCAPV-1），其基因组在人与犬样本中均被检测到。该病毒属于原细小病毒属（Protoparvovirus），与狐狸Newlavirus亲缘关系最近，其衣壳蛋白氨基酸替换及潜在基因组重组事件提示其可能具备跨物种传播能力。研究强调了在人与伴侣动物密切接触环境中进行病毒监测的重要性。
发现人咽部分泌物中的新型细小病毒
为研究人咽部病毒的多样性并评估其潜在健康影响，研究者启动了“人咽部分泌物宏病毒组计划”。通过对2020年至2022年间收集的200多份人咽部分泌物样本进行新一代测序（NGS），研究团队在一个文库（文库ID HOS114）中意外地发现了一个近乎完整的细小病毒基因组。BLASTn分析显示，该病毒与意大利狐狸中检测到的原细小病毒属（Protoparvovirus）成员Newlavirus strain ITA/2013/51.20-65最为接近，核苷酸序列一致性为75.59%。由于在人类样本中发现同源性如此低的新型真核病毒非同寻常，研究者将该病毒基因组作为参考，对所有其他文库进行比对，结果在另外两个文库（HOS115和HOS116）中也发现了该新型细小病毒的序列读段。通过桑格测序，研究者确认了该细小病毒的完整基因组，长度为4,989 bp。
在犬群中追踪该新型细小病毒
鉴于该病毒与在狐狸中广泛发现的Newlavirus亲缘关系密切，且犬与狐狸同属犬科，研究者随即在犬群中对该病毒进行了分子溯源研究。首先对108份先前保存的犬淋巴结样本和3只死亡流浪犬的全身组织样本进行了检测。针对对病毒感染性至关重要的VP基因244-nt片段进行PCR筛查，结果显示108份犬淋巴结样本中有24份呈阳性，阳性率为22.22%。在其中一只死亡流浪犬的多个组织（包括下颌淋巴结、咽后淋巴结、脑、脾、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、胃、小肠和血液）中均检测到该病毒，表明这种新型细小病毒具有广泛的感染特性和全身扩散的潜力。由于该病毒在人和犬样本中均有发现，研究者将其命名为人犬相关细小病毒1型（HCAPV-1）。
获取犬源HCAPV-1基因组
为了获得犬样本中的HCAPV-1完整基因组，研究者对HCAPV-1阳性的犬淋巴结样本进行了NGS测序，并将完整的HCAPV-1基因组与NGS数据进行比对以寻找同源基因组。然而，大多数文库中仅包含少量与HCAPV-1基因组匹配的序列读段，反映了HCAPV-1在犬淋巴结样本中的病毒载量较低。随后，研究者以人源HCAPV-1基因组为模板设计引物，进行全基因组扩增，并结合桑格测序，最终从犬淋巴结组织中获得了8个与HCAPV-1同源的细小病毒序列。这些序列长度在4,795至4,807 bp之间，相互间核苷酸一致性超过98%，且所有犬源HCAPV-1基因组与完整的HCAPV-1基因组核苷酸序列一致性均超过96%。至此，研究者共获得了9个不同的HCAPV-1基因组序列。
HCAPV-1的基因组特征
通过与两个狐狸相关的Newlavirus（原细小病毒属）基因组进行BLASTn比对，确定了HCAPV-1的基因组结构。基于人咽部分泌物来源的HCAPV-1基因组，该病毒表现出典型的原细小病毒组织模式，GC含量为40.0%。其基因组包含部分5‘非翻译区（150 bp）、完整的非结构蛋白1（NS1）开放阅读框（ORF，编码620个氨基酸）、完整的病毒蛋白VP1（740 aa）和VP2（581 aa）的ORF，以及部分3’非翻译区（201 bp）。HCAPV-1基因组含有高度保守的蛋白结构域，包括NS1蛋白中与ATP或GTP结合相关的基序，如Walker A环（GPASTGKS）、Walker B基序（IIWVEE）、Walker B‘基序（KAICSGQSIRIDQK）和Walker C基序（PVIITTN）。此外，NS1蛋白还包含两个保守的复制起始子基序：xxHuHxxxx（KLHIHVLLH）和YxxxK（YFLQK）。在VP1的N端发现了磷脂酶A2（PLA2）催化残基DxxAxxHDxxY（DAAAQRHDHAY）及其高度保守的钙结合环（GPGN）。
进一步调查人与犬咽部分泌物中的HCAPV-1
为了进一步探究HCAPV-1在密切接触的人和犬中的存在情况，研究者收集了126份宠物犬咽部分泌物样本和62份其密切接触者的额外样本，使用上述特异性PCR引物进行病毒检测。此外，还检测了270份发热患者的咽部分泌物样本，以调查HCAPV-1感染与发热之间是否存在关联。结果显示，126份宠物犬咽部分泌物样本中有3份阳性，阳性率为2.38%。62份密切接触者样本中有2份阳性，阳性率为3.23%。值得注意的是，尽管采样框架包括了宠物犬及其密切接触者，但阳性的人和犬病例并非来自对应的人犬组合。此外，所有发热患者的咽部分泌物样本检测结果均为阴性。
HCAPV-1及其变异株的系统发育分析
为了确定HCAPV-1、其变异株与先前鉴定的细小病毒之间的进化关系，研究者基于全基因组、NS1和VP1基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列构建了系统发育树。在所有分析中，HCAPV-1及其变异株始终与Newlavirus组成员关系密切，并稳定地聚集在原细小病毒属内。使用SDT v1.3对NS1蛋白进行距离矩阵分析显示，HCAPV-1及其变异株与Newlavirus的氨基酸一致性不超过77%。根据ICTV对原细小病毒属内物种分类的标准，同一物种的病毒必须是单系群，且其NS1蛋白氨基酸序列一致性需超过85%。因此，HCAPV-1及其变异株应被归类为一个新物种。
二级结构预测
病毒序列的衣壳蛋白常出现宿主特异性突变并表现出频繁的平行进化。蛋白质二级结构（如α-螺旋和β-折叠）的改变可能导致三维构象变化，进而引起蛋白质功能的丧失或改变。为了探究HCAPV-1及其变异株空间结构的潜在差异，研究者使用EMBOSS套件中的Garnier程序预测了其NS1和VP1氨基酸序列的二级结构。结果显示，这9个病毒在NS1中存在7个氨基酸差异，在VP1中存在8个氨基酸差异，这可能与VP1相对不保守有关。这些氨基酸变异导致了NS1和VP1中至少四个区域的二级结构发生改变，可能影响蛋白质功能。值得注意的是，与共有序列相比，HCAPV-1.7表现出9个氨基酸替换（NS1中3个，VP1中6个），表明其相对于其他同源序列具有更复杂的变异模式。其次是HCAPV-1.8（NS1中2个，VP1中5个），HCAPV-1（NS1中2个，VP1中3个）和HCAPV-1.6（NS1中1个）。
HCAPV-1的基因组重组分析
基因组和系统发育分析表明，HCAPV-1可能是狐狸与其他犬科动物之间交叉感染或共享共同病毒源的结果。为了进一步表征原细小病毒进化中可能的重组事件，研究者使用重组检测程序RDP5 v5.58对HCAPV-1及其他五种病毒（包括犬细小病毒2c、加州海狮细小病毒和两个Newlavirus毒株）的全基因组序列进行了分析。结果显示，9种检测方法中有3种支持在比对位置1,849至1,924之间存在重组区域，对应于HCAPV-1基因组中一个76 bp的片段（位置1,565至1,640）。值得注意的是，编码HCAPV-1基因组中部分Walker B‘基序和完整Walker C基序的核苷酸序列位于这个推定的重组区域内，可能影响相关蛋白的ATP结合、水解和DNA转运活性。在系统发育分析中，HCAPV-1在核苷酸片段1至1,848和1,925至序列末端与Newlavirus亲缘关系最近，然而在核苷酸1,849至1,924之间，HCAPV-1与2010年在阿根廷家犬中发现的犬细小病毒2c关系最为密切。此外，使用SimPlot软件对潜在重组区域进行的相似性图分析进一步证实了HCAPV-1基因组内存在重组事件。
讨论
病毒的宿主范围，即其能够感染的物种多样性，对于理解其引发新发传染病的潜力至关重要。本研究中，在人类中检测到的HCAPV-1序列与在犬中鉴定的序列具有高度遗传相似性，提示该病毒可能在两个宿主群体中循环。然而，这并不必然意味着存在犬与人之间的直接传播。其他解释也应被考虑，例如两个物种可能共同暴露于某个环境源。鉴于检测率较低且样本元数据有限，区分这些可能性的能力受到限制。需要额外的流行病学数据，特别是时空关联的采样和更广泛的环境监测，来澄清这些传播模式。
系统发育分析表明，HCAPV-1及其变异株与近期在加拿大和意大利报道的Newlavirus存在显著差异，这凸显了人们对这些病毒的进化史和传播生态学知之甚少。此外，HCAPV-1的VP基因表现出显著的遗传多样性，这与其它原细小病毒（如CPPV-1）通常观察到的强保守性形成对比，后者即使少数点突变也可能导致显著的生物学效应。这些发现揭示了HCAPV-1进化的复杂性，并强调需要进一步研究以阐明这种变异的功能重要性。
拥有更广地理覆盖范围、更广泛采样和长期观察的更大数据集，对于澄清HCAPV-1的分布和宿主范围以及评估任何可能的临床相关性至关重要。随着数据的积累，我们对细小病毒多样性和进化的理解有望变得更加全面。在人和犬中均检测到HCAPV-1也凸显了在人与伴侣动物密切互动的环境中持续进行病毒监测的必要性。
材料与方法
样本收集与文库构建：HCAPV-1最初是从尚未发表的“人咽部分泌物宏病毒组计划”产生的数据子集中鉴定出来的。人咽部分泌物使用一次性棉签收集，存入无菌容器，并立即在干冰上运输至实验室。进行宏病毒组分析前，将收集的棉签尖端浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，剧烈涡旋，离心后取上清液用于后续分析。通过过滤去除非病毒颗粒，并使用RNase和DNase处理滤液以消化未受保护的核酸。然后使用试剂盒提取总核酸，进行逆转录和DNA合成。使用Nextera XT DNA样本制备试剂盒构建文库，并在Illumina NovaSeq平台上进行测序。所有步骤均采取必要措施防止样本交叉污染和核酸降解。
序列数据组装与HCAPV-1鉴定：为减少宿主污染，从NCBI获取人参考基因组序列，并使用Bowtie2 v2.4.5从文库中比对并去除潜在宿主序列。使用Trim Galore进行引物和低质量序列修剪。使用MEGAHIT v1.2.9默认参数组装双末端读段。将重叠群与非冗余蛋白数据库使用DIAMOND v2.0.15中的BLASTx工具进行比对。使用TaxonKit进行病毒分类，并从结果中筛选出目标病毒。使用Geneious Prime预测推定ORF，并通过与相关病毒的ORF进行比较进行验证。使用保守域数据库进行注释。最终，通过桑格测序填补缺失区域后，鉴定出命名为HCAPV-1的新型细小病毒完整基因组。
分子流行病学检测：本流行病学调查包括以下样本：108份实验室保存的死亡流浪犬淋巴结组织；3只其他死亡流浪犬的全身组织；126份2024年从宠物诊所收集的宠物犬咽部分泌物样本；62份宠物犬密切接触者的咽部分泌物样本；270份发热个体的咽部分泌物样本。使用特异性设计的引物采用巢式PCR方法进行筛查。
同源序列的全基因组扩增：用于全基因组扩增的PCR引物和序列信息详见附表。反应条件包括预变性、变性、退火和延伸步骤。
系统发育分析：为阐明系统发育关系，从GenBank数据库下载了不同细小病毒群的序列以及待批准的建议物种序列。使用MEGA-11中的MUSCLE比对核苷酸或蛋白质序列。暂时从比对中去除包含超过50%空位的位点。然后使用IQ-TREE v1.6.12构建最大似然树。所有系统发育树均使用IQ-TREE创建，并进行1,000次自举重复。使用Interactive Tree Of Life可视化和编辑系统发育树。
潜在基因组重组事件预测：使用RDP5软件的默认算法分析和过滤潜在重组事件。使用SimPlot软件进一步验证识别的重组事件。
