《Microbiology Spectrum》：Gasdermin E is dispensable for H1N1 influenza virus pathogenesis in mice
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本研究通过严谨的体内实验，首次明确揭示 gasdermin E (GSDME) 在小鼠模型中，对于严重H1N1流感病毒（包括经典的PR8毒株和2009年大流行毒株）诱导的肺功能损伤、组织病理、病毒载量、炎症水平及死亡率等关键致病指标均无显著影响。这一发现修正了先前认为GSDME介导的细胞焦亡在流感致病中具有普遍性的观点，强调了gasdermin家族成员在流感发病机制中的作用具有显著的病毒株特异性，这对于理解不同流感亚型的致病机理及开发靶向细胞死亡通路的精准治疗策略具有重要意义。
引言
流感病毒仍是全球范围内导致住院和死亡的主要原因之一。严重的流感发病部分是由过度活跃的宿主免疫反应驱动，其可引发过度炎症、组织损伤，并最终导致呼吸衰竭。多种程序性细胞死亡形式，包括细胞凋亡、坏死性凋亡和细胞焦亡，在严重流感病毒感染期间的肺病理中发挥作用。其中，细胞焦亡尤为重要，它是由gasdermin蛋白家族成员介导的，包括gasdermin D (GSDMD) 和 gasdermin E (GSDME)。虽然GSDMD已被证明能加剧流感病毒诱导的肺病理，并且在H3N2和H7N9毒株感染中，GSDME缺失可改善疾病结局，但GSDME在H1N1流感病毒感染中的作用此前尚未在体内明确评估。鉴于H1N1病毒在全球范围内导致了相当比例的严重流感病例，阐明其发病机制至关重要。
结果
GSDME不影响H1N1流感病毒感染的发病率和死亡率
为了研究GSDME在H1N1流感病毒感染中的作用，本研究使用了Gsdme-/-基因敲除小鼠。研究人员首先通过蛋白质免疫印迹和PCR确认了小鼠肺部组织中GSDME蛋白的缺失，而相关的gasdermin家族成员GSDMD的表达在两种基因型小鼠间没有变化。实验使用雌性野生型（WT）和Gsdme-/-小鼠，经鼻感染50 TCID50的小鼠适应性A/PR/8/34病毒。结果显示，在感染后第7天，两组小鼠肺部的病毒滴度相似。在整个感染过程中监测的体重下降情况，在两种基因型小鼠间也未观察到显著差异。在生存率方面，Gsdme-/-小鼠的表现略好于野生型，但差异无统计学意义。此外，在感染后第7天测量肺部匀浆中IL-1β、IL-18、TNF、IL-6和IFN-β的水平，也未发现显著差异。这些数据综合表明，GSDME并不显著影响PR8 H1N1病毒感染期间的疾病严重程度或炎症反应。这些发现得到了可视化数据的支持，该图表综合展示了基因型确认、病毒滴度、体重变化、生存曲线和细胞因子水平的对比，直观地呈现了WT和Gsdme-/-小鼠在疾病进展上的高度一致性。
GSDME不参与H1N1病毒感染期间的肺部病理或功能障碍
鉴于GSDME缺失对H1N1感染的总体结局没有明显影响，研究者进一步探究了在缺乏GSDME的小鼠肺部是否存在更细微的影响。通过对感染后第7天采集的肺部组织进行苏木精-伊红染色，观察到WT和Gsdme-/-小鼠均存在炎症区域、免疫细胞浸润、肺泡壁增厚和组织损伤，且基于软件的定量分析显示组织实变程度在两组间无显著差异。同样，抗CD45染色显示两组肺部免疫细胞浸润水平相似，平滑肌肌动蛋白染色也显示支气管周围和血管周围的染色模式在两组间具有可比性，表明在平滑肌活化或纤维增生性重塑方面没有基因型特异性差异。作为肺功能障碍的高度敏感指标，研究人员通过全身体积描记法测量了增强呼气间歇和峰值呼气流量时间比。结果显示，在感染期间，这两种肺功能参数在两种基因型小鼠中均表现出相似的增长模式，组间无统计学显著差异。这些结果进一步表明，在H1N1流感病毒感染中，GSDME对于肺部病理和功能障碍是非必需的。该组图通过组织病理学染色图片和量化数据，以及随时间变化的肺功能参数折线图，有力地证明了GSDME缺失并未改变H1N1感染导致的肺组织损伤和呼吸功能变化。
GSDME在有或无感染状态下对肺部整体转录程序影响甚微
为了探究GSDME是否影响流感病毒感染期间肺部的全局基因表达，研究对感染后第7天的WT和Gsdme-/-小鼠全肺进行了RNA测序分析。主成分分析显示，感染样本与模拟感染样本之间存在显著分离，但在模拟感染或感染条件下，WT和Gsdme-/-动物之间的分离极小。差异表达基因分析进一步证实，在模拟感染的WT与Gsdme-/-小鼠之间，或在PR8感染的WT与Gsdme-/-小鼠之间，仅有极少数基因表达发生改变。将感染小鼠与其基因型匹配的未感染对照进行比较，分析显示，病毒感染调控的差异表达基因在两种基因型间有约66%的重叠，且这些基因变化的方向高度一致。值得注意的是，GSDME的缺失对干扰素刺激基因编码的抗病毒效应分子的诱导幅度影响极小。基因本体富集分析表明，两种基因型重叠的差异表达基因涉及“先天免疫反应调控”和“炎症反应调控”等通路。基因集富集分析也显示，在WT和Gsdme-/-小鼠中，前10个诱导的、富集程度相当的通路均与抗病毒和促炎反应相关。对仅在WT或仅在Gsdme-/-小鼠中差异表达的基因子集进行分析发现，WT小鼠在“肺发育”和“肌肉细胞分化”相关通路有独特富集，而Gsdme-/-小鼠则独特富集了“跨膜转运负调控”和“肌肉系统过程调控”相关基因。然而，尽管存在这些转录组差异，但在基线或感染期间并未观察到相应的功能性肺部差异，且平滑肌肌动蛋白染色结果相似，表明这些微弱的转录组变化在严重H1N1感染的背景下不具有生物学意义。转录组学分析还显示，尽管Gsdmd基因在感染小鼠中表达显著增加，但在WT或Gsdme-/-小鼠之间，其他gasdermin家族成员在模拟或感染条件下的表达均无差异，表明不存在通过其他gasdermin成员表达上调来补偿GSDME缺失的情况。该图通过主成分分析图、火山图和热图等可视化手段，清晰地展示了WT和Gsdme-/-小鼠在感染后肺部转录组的惊人相似性，特别是在关键的干扰素和炎症反应通路上。
GSDME不影响经轻微鼠适应的2009年大流行H1N1流感病毒感染结局
为了严谨验证在PR8毒株中观察到的发现是否具有普遍性，研究者使用了另一种H1N1毒株——仅带有一个鼠适应性PB2蛋白突变的A/California/04/09进行感染实验。结果显示，在感染这种病毒后，WT和Gsdme-/-小鼠表现出相似的体重下降模式、几乎相同的生存率，以及由增强呼气间歇和峰值呼气流量时间比指示的相似的肺功能障碍模式。在按性别分组分析时，雌性小鼠表现出更严重的感染，但无论在雌性还是雄性小鼠中，WT和Gsdme-/-小鼠在体重下降、生存率或肺功能障碍方面均无显著差异。这些结果进一步证明，GSDME并非严重H1N1流感病毒感染中发病或死亡的主要贡献者，且这一发现在雄性和雌性小鼠以及不同的H1N1毒株中均适用。该组图通过体重变化、生存曲线和肺功能参数，直观地展示了在另一种H1N1毒株感染下，GSDME缺失小鼠与野生型小鼠的疾病进程依然没有差异。
讨论
先前的研究已将细胞焦亡，特别是GSDMD依赖的细胞焦亡，与流感病毒感染期间驱动的肺部炎症和病理联系起来。对已发表的肺部单细胞RNA测序数据的挖掘显示，GSDME在多种人和小鼠肺细胞中均有表达，包括巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞，这些细胞是流感病毒的已知靶点并在流感发病中发挥作用。有趣的是，Gsdme-/-小鼠在高致病性禽源H7N9病毒感染中显示出存活率提高，近期另一项研究也报道了Gsdme-/-小鼠在H3N2感染期间疾病评分和生存率有适度改善。然而，GSDME是否同样影响在全球范围内造成大量病例和住院负担的H1N1流感病毒引起的肺部发病，此前尚未得到检验。尽管多项体外研究表明H1N1感染可在人肺上皮细胞系、人原代支气管上皮细胞系和小鼠肺组织中触发caspase-3及其后续的GSDME切割，但本研究首次在体内评估了GSDME对H1N1流感病毒致病性和死亡率的贡献。研究发现，与H7N9和H3N2感染不同，H1N1流感病毒的致病性基本上不受GSDME缺失的影响，且这种效应并非由于其他gasdermin家族成员的代偿性表达。全局转录组分析显示，Gsdme-/-小鼠的某些肺部炎症基因程序有适度减弱，并独特地富集了涉及“跨膜转运负调控”和“肌肉收缩调控”的通路。尽管存在这些转录差异，但两组小鼠在体重下降、生存率、肺功能和组织病理学方面仍保持相似。进一步分析显示，野生型小鼠中与肺发育和肌肉细胞分化相关的基因通路有所富集。然而，考虑到基线或感染期间缺乏功能性的肺部差异，以及各组间平滑肌肌动蛋白染色相似，这些微弱的转录组变化在严重H1N1感染的背景下可能不具有生物学意义。不过，这些数据提示GSDME可能在组织重塑或修复中发挥作用，特别是在反复感染或其他肺损伤之后。同样，虽然在整个观察期间，WT和Gsdme-/-动物在疾病临床症状上无显著差异，但不能完全排除GSDME在感染后第7天前的时间点可能产生的影响。重要的是，研究者在两个不同的严重H1N1感染模型中都观察到了GSDME缺失的极小影响，即使用1934年的经典PR8毒株和作为当前人类流行H1N1毒株前体的2009年大流行病毒。结合先前使用Gsdmd-/-小鼠、相同病毒和剂量进行的研究所显示出的显著保护效果，这提示在H1N1感染中，炎性小体或GSDMD依赖的细胞焦亡比与凋亡相关的GSDME依赖的细胞焦亡更为重要。需要指出的是，本研究的局限在于，小鼠可能无法完全复现人类疾病。关于H1N1感染的研究结果结合现有文献也表明，不同的流感病毒亚型可能激活独特的细胞死亡和致病程序。虽然所有流感病毒亚型都可能诱导宿主细胞死亡，但细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡等特定通路的相对贡献可能因病毒毒株、复制动力学以及宿主免疫参与和拮抗的差异而不同。H1N1病毒，特别是PR8和2009年大流行毒株，已被证明能强烈激活炎性小体信号并驱动caspase-1依赖的细胞焦亡，这与GSDMD在这些模型中的关键角色一致。而H3N2和H7N9毒株可能更有效地逃避这种GSDMD依赖的炎性小体通路，或更强烈地激活细胞凋亡通路，导致caspase-3和GSDME的切割增加。这些差异可能反映了各亚型与先天免疫传感器相互作用或逃避、诱导应激反应、或感染肺内不同靶细胞群的方式存在根本性不同。总体而言，本研究的发现揭示了在评估特定细胞死亡通路对疾病严重程度的贡献时，考虑流感病毒亚型的重要性。GSDME已被证明在肿瘤抑制和化疗诱导的细胞死亡中发挥作用。目前尚不清楚GSDME是否在继发性细菌感染（这是包括H1N1感染在内的严重流感的常见并发症）背景下发挥更重要的作用。共感染可能增加上皮细胞或免疫细胞的凋亡，导致GSDME切割增强，并可能改变炎症性细胞死亡通路的平衡。此外，尽管转录组分析显示抗病毒和炎症基因的表达仅有微小变化，但GSDME是否影响肺部修复过程仍有待确定。未来可能需要结合共感染模型、高分辨率转录组学方法或对感染小鼠的长期随访研究，以全面界定GSDME在H1N1流感病毒感染中微妙或依赖特定背景的作用。最后，本研究发现Gsdme-/-小鼠在H1N1流感病毒感染期间的疾病结局差异极小，这表明在其他临床背景下靶向GSDME的治疗可能不会对H1N1流感病毒的易感性或致病性产生意外后果。总之，本研究结果表明，GSDME在H1N1流感病毒的致病机制中作用甚微，这将其与其他亚型区分开来，在其他亚型中GSDME依赖的细胞焦亡可能更为重要。这些结果完善了我们对gasdermin家族成员在病毒性疾病中作用的理解，并强调了在评估宿主反应和疾病发病机制时考虑病毒株特异性差异的必要性。
