《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Valorization of Cricket Biomass into a Sustainable High-Performance Peptone for Microbial Culture Media
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蟋蟀幼虫经Alcalase-Trypsin串联酶解制备高性能蛋白粉（cricktone），响应面法优化温度（52.5℃/37-38℃）及酶浓度，总游离氨基酸提升3.8倍，水解度达33-35%，喷雾干燥后产品含氮13.25%、氨基酸氮4.20%，水分2.20%，支持大肠杆菌等四株菌与商业蛋白相当的生长动力学（R2>0.99），且缩短延滞期达70%，为可持续生物发酵氮源提供新方案。
瓦拉蓬·昌南基特（Waraporn Chamnankit）|帕尼帕克·帕卡克龙（Panipak Pakakrong）|蒙通·勒特沃拉普里查（Monthon Lertworapreecha）
泰国塔克辛大学（Thaksin University）科学与数字创新学院（Faculty of Science and Digital Innovation）生物技术项目，邮编93210
摘要
基于昆虫的生物制品的迅速发展增加了人们对开发可持续替代品（以替代动物和植物来源的蛋白胨）的兴趣，然而大多数关于昆虫蛋白的研究并未显示出与商业基质相当的功能性能。本研究提出了一种顺序性的碱性酶-胰蛋白酶水解策略，将Brachytrupes portentosus生物质转化为具有优化生化特性的高性能蛋白胨（cricktone）。响应面法（Response Surface Methodology, RSM）确定温度和酶浓度是影响肽释放和游离氨基氮释放的主要因素：碱性酶在约52.5°C时表现出最佳活性，而胰蛋白酶在37–38°C时效率最高。优化后的两步水解过程使总游离氨基酸（ΣFAA）含量比未水解对照组增加了约3.8倍，并实现了约33–35%的水解程度。所得水解物通过喷雾干燥成功制成稳定性高的粉末，回收率达到了95.3%，该蛋白胨含有13.25%的总氮和4.20%的氨基氮，且水分含量较低（2.20%）。当将其添加到微生物培养基中时，cricktone支持了大肠杆菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的生长，其生长动力学参数（μmax, λ, Xmax）与使用酪蛋白和豆基蛋白胨得到的结果相差在±5–10%范围内，模型拟合度非常好（R2 > 0.99）。值得注意的是，与商业蛋白胨相比，某些菌株的潜伏期显著缩短（最长可缩短约70%），表明其适应性更强。这些发现首次提供了定量证据，证明昆虫来源的水解物在微生物培养中可以与传统蛋白胨具有相同的功能性，从而将蟋蟀生物质定位为发酵工业和实验室微生物学领域一种可靠、可扩展且可持续的氮源。
引言
全球生物技术行业的快速发展增加了对高效且成本效益高的微生物培养基的需求，尤其是在生物制药、益生菌和工业酶的生产方面（Miranda & Nader-Macías, 2023; Valle Vargas et al., 2024）。蛋白胨是一种富含肽和氨基酸的蛋白质水解物，是支持微生物生长和代谢物合成的主要氮源。传统蛋白胨主要来源于哺乳动物或植物；然而，哺乳动物来源的蛋白质存在朊病毒传播风险（Koutsoumanis et al., 2020; Piccardo et al., 2011），同时还受到文化和宗教限制，例如清真食品要求（Herdiana et al., 2024; Pratiwi et al., 2025）。此外，基于牲畜的蛋白质生产面临着环境足迹较大的问题，包括温室气体排放、土地使用和水资源消耗，这凸显了寻找更可持续替代品的需求（Hur et al., 2024; Rehman et al., 2024）。
在循环生物经济框架下，可食用昆虫因其高营养价值、良好的饲料转化效率和可持续性潜力而受到关注。巨型蟋蟀（Brachytrupes portentosus）在东南亚广泛养殖，其干重中含有50–65%的蛋白质，且必需氨基酸组成平衡，适合微生物营养（Chaiongkarn et al., 2024; Magara et al., 2025; Phesatcha et al., 2022）。然而，其利用目前主要局限于食品和饲料领域，作为高价值微生物培养基的潜力尚未得到充分探索。
酶水解被广泛用于将富含蛋白质的生物质转化为功能性蛋白胨，因为它能够实现可控的肽切割并生成适合微生物吸收的分子量组分。虽然已有单酶水解的报道，但使用互补蛋白酶的顺序策略可以进一步提高水解程度（%DH）和游离氨基酸释放量（ΣFAA）（Sapatinha et al., 2025; Tacias-Pascacio et al., 2020）。因此，使用响应面法（RSM）优化水解参数对于确保蛋白胨质量达到商业标准至关重要。
据此，本研究旨在通过Box–Behnken设计（BBD）优化的顺序碱性酶-胰蛋白酶水解策略，将B. portentosus生物质转化为高质量的微生物培养基蛋白胨。通过比较使用商业蛋白胨培养的大肠杆菌、沙门氏菌属细菌、金黄色葡萄球菌和益生菌乳酸菌的生长动力学，评估了所得蟋蟀蛋白胨的性能。这种方法提供了一种无BSE风险且可持续的氮源，同时为昆虫养殖产业链增加了价值。
原材料与制备
实验所用成年蟋蟀（Brachytrupes portentosus）大约60天大，购自泰国帕帕勇县（Pa Phayom District）的Sakkarin蟋蟀农场。蟋蟀在标准商业养殖条件下饲养，持续供应水和商业配方蟋蟀饲料，约60天后收获。收获后用自来水彻底清洗以去除附着物和杂质，再用蒸馏水冲洗。
筛选适用于蟋蟀蛋白胨生产的水解酶
通过分析水解产物的ΣFAA谱，评估了四种商业蛋白酶（木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和碱性酶）水解蟋蟀蛋白的效率。设置了一个无酶添加的对照组（No Enzyme）作为基准。氨基酸组成的比较分析见表1。结果表明，与未水解对照组相比，酶水解显著增强了游离氨基酸的释放。
讨论
本研究将B. portentosus生物质转化为高性能微生物蛋白胨（cricktone），满足了工业生物技术领域对可持续和安全氮源的需求。采用碱性酶-胰蛋白酶的顺序水解策略显著提高了蛋白质回收率和氨基酸的生物利用度，优于单一酶处理方法。
结论
本研究建立了一种将蟋蟀生物质转化为高性能微生物蛋白胨的可靠生物工艺，其生化质量和促进生长的效率可与商业动物和植物来源的基质相媲美。优化的顺序水解过程显著提高了肽的可用性和氨基氮的释放量，减少了对外部传统蛋白质来源的依赖。通过将一种未充分利用的昆虫资源转化为
CRediT作者贡献声明
帕尼帕克·帕卡克龙（Panipak Pakakrong）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、数据管理。瓦拉蓬·昌南基特（Waraporn Chamnankit）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验设计、数据分析、数据管理。蒙通·勒特沃拉普里查（Monthon Lertworapreecha）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目协调、资金获取、数据分析、概念构思伦理声明
本研究未涉及使用脊椎动物、人类参与者或需要伦理批准的程序。所用蟋蟀为从商业渠道获得的可食用昆虫材料。
利益冲突声明
作者声明获得了塔克辛大学科学与数字创新学院（Faculty of Science and Digital Innovation）提供的行政支持和设备支持。其中一位作者还拥有与昆虫蛋白胨技术相关的专利申请（申请编号2401008351）。所有其他作者声明没有已知的财务利益或可能影响本文研究的个人关系。
资金来源
本研究项目得到了塔克辛大学研究与创新基金（Research and Innovation Fund）2026财年的资助（资助编号FF2569-213201）。利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：蒙通·勒特沃拉普里查（Monthon Lertworapreecha）获得了塔克辛大学科学与数字创新学院提供的行政支持和设备支持。该作者还拥有与昆虫蛋白胨技术相关的专利申请（申请编号2401008351）。所有其他作者声明没有已知的财务利益或致谢
作者感谢塔克辛大学科学与数字创新学院的农业、食品与环境微生物技术研究中心（Microbial Technology for Agriculture, Food and Environment Research Center）提供的实验室设施、设备和技术支持，这些对于完成本研究至关重要。本研究项目得到了塔克辛大学研究与创新基金（Research and Innovation Fund）2026财年的资助（资助编号FF2569-213201）。
