《Bioactive Materials》：Development of a
PTEN-siRNA activated scaffold to promote axonal regrowth following spinal cord injury
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本文推荐一项关于脊髓损伤修复的前沿研究。为解决脊髓损伤后神经元再生困难及缺乏有效治疗手段的难题，研究团队开发了一种装载PTEN-siRNA的非病毒纳米粒子（GET-siRNA）功能化透明质酸支架。该“基因激活支架”在体外成功转染神经元，实现PTEN基因的特异性、长效沉默，并激活下游PI3K/AKT/mTOR通路，最终显著促进了损伤后神经元的轴突再生。这项研究为开发治疗中枢神经损伤的多功能植入物提供了新思路，论文发表于《Bioactive Materials》。
脊髓是连接大脑与全身的通信主干道，一旦受损，往往导致瘫痪等严重后果。然而，脊髓损伤的治疗是医学界长期面临的巨大挑战。这背后是双重困境：一方面，损伤形成的瘢痕和囊性空腔构成了不利于再生的外部“路障”；另一方面，成年神经元内在的再生能力极其低下，成为其“自身惰性”。虽然植入性生物材料支架有望为轴突再生提供物理桥梁和微环境支持，但如何同时“唤醒”神经元的内在生长潜能，是实现功能恢复的关键。
近期，基因疗法，特别是RNA干扰（RNAi）技术，为改变神经元的内在状态带来了希望。通过抑制特定的修复抑制基因，有望促使受损的神经元重新生长。其中，磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）是备受关注的靶点，它通过抑制PI3K/AKT/mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）这条关键的细胞生长和存活通路，从而强烈抑制轴突的生长。那么，能否将这种精准的基因调控工具与支持性的生物材料支架结合起来，协同攻克脊髓损伤修复的内外障碍呢？
在发表于《Bioactive Materials》的最新研究中，Tara K. McGuire等研究人员给出了肯定的答案。他们成功开发了一种先进的“基因激活支架”系统，将靶向PTEN基因的小干扰RNA（siRNA）与一种名为糖胺聚糖结合增强转导（GET）的非病毒肽纳米载体结合，然后装载到一种经过优化的透明质酸（Hyaluronic acid, HyA）基脊髓损伤修复支架（SCI-scaffold）中。这种双重功能的平台不仅能作为组织再生的物理支撑，还能在损伤部位局部、持续地递送治疗性siRNA，精准调控神经元基因表达，最终显著促进了轴突的再生。
研究者们运用的关键技术方法包括：利用非病毒GET肽与siRNA自组装形成纳米粒子（siRNA-nanoparticles）；采用冷冻干燥技术制备具有纵向排列孔道结构的透明质酸基生物材料支架；通过浸渍负载将siRNA纳米粒子整合到支架中（siRNA-activated scaffold）；使用小鼠运动神经元样细胞系（NSC34）以及从胚胎第18天（E18）小鼠中分离的原代皮层、海马和脊髓神经元进行体外二维和三维培养模型验证；通过qRT-PCR（定量逆转录聚合酶链反应）和蛋白质印迹法（Western Blot）评估基因和蛋白的敲低效率；通过体外鸡胚脑片培养模型评估支架在更复杂组织环境中的转染能力。
3.1. PTEN-siRNA纳米粒子能够在不影响神经元健康的情况下实现短暂且特异性的基因沉默
研究人员首先证明了GET-siRNA纳米粒子可以有效转染有丝分裂后的神经元。在二维培养的NSC34神经元中，100 nM的PTEN-siRNA纳米粒子在转染后第3天使PTEN的mRNA表达降低了约66.6%，且到第7天时表达恢复至基线水平，证明了其沉默的短暂性和特异性。使用乱序siRNA（scrambled siRNA）的对照组则对PTEN表达无影响。重要的是，这种基因沉默并未对神经元的代谢活性、形态或神经突的生长产生不良影响，证实了该递送系统的生物相容性。
3.2. PTEN-siRNA纳米粒子介导的基因沉默在原代神经元中表现出良好的细胞相容性并能显著降低PTEN表达
为了验证其在更接近体内环境的细胞中的效果，研究在原代神经元中进行了测试。来自小鼠皮层、海马和脊髓的原代神经元均能被成功转染。其中，皮层神经元在转染3天后，PTEN的mRNA表达被敲低了93%，蛋白水平也降低了约73%。尽管在100 nM浓度下观察到代谢活性有所下降，但细胞损伤标志物乳酸脱氢酶（LDH）的释放反而降低，且神经元形态未受影响。当使用50 nM浓度时，不仅实现了有效的PTEN敲低，还观察到了下游效应：抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达显著上调，同时mTOR通路激活标志物磷酸化S6核糖体蛋白（pS6）的表达也呈上升趋势。这证实了PTEN敲低成功激活了PI3K/AKT/mTOR通路。
3.3. 开发用于高效转染和营养支持神经元生长的siRNA激活支架
在二维验证成功后，研究进入三维阶段。研究人员将GET-siRNA纳米粒子负载到他们之前开发的、补充了胶原IV的柔软且各向异性排列的透明质酸支架（SCI-scaffold）中。扫描电镜和共聚焦显微镜成像证实纳米粒子成功分布在支架内部和表面。负载效率约为80%，并且纳米粒子在21天内呈现先快速释放后缓慢持续释放的动力学特征。重要的是，释放到培养基中的纳米粒子量不足以对周围神经元产生基因沉默效应，表明支架能将治疗载体主要保留在局部。当将原代皮层神经元种植在负载了荧光标记siRNA（siGLO）的支架上时，共聚焦成像显示神经元成功摄入了纳米粒子。
3.4. 支架介导的siRNA递送导致PTEN表达的长效下调并刺激生长和恢复相关基因的表达增加
在三维培养体系中，研究人员评估了PTEN-siRNA激活支架对神经元的长期影响。在长达21天的培养中，支架展现出良好的生物相容性。基因表达分析显示，神经元在支架上培养3天后，PTEN mRNA表达显著降低（约48%），且这种抑制效果可持续更长时间，直到21天才逐渐向基线水平恢复。与此同期，作为PTEN敲低下游效应的Bcl-2和生长相关蛋白43（GAP-43）的mRNA表达均在早期（第3天）显著上调，随后逐渐下降。这表明支架不仅能实现长效的基因治疗，还能成功诱导出有利于神经元存活（Bcl-2）和轴突生长（GAP-43）的分子程序。
3.5. PTEN-siRNA激活支架有效刺激受损原代皮层神经元的神经突生长
最后，研究在更复杂的体外模型——包含神经元和胶质细胞（如星形胶质细胞）的原代混合皮层细胞培养中，测试了支架的功能。将细胞机械性损伤后种植在PTEN-siRNA激活支架或空白支架上。生物相容性测试显示两者无差异。然而，关键的形态学分析表明，生长在PTEN-siRNA激活支架上的神经元，其最长的神经突长度显著增加。同时，对促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的检测未发现支架引起炎症反应加剧。
3.6. PTEN-siRNA激活支架能够转染离体鸡胚脑片
为了在更接近体内组织的环境中验证支架的转染能力，研究使用了离体（ex vivo）鸡胚脑片培养模型。将脑组织置于siRNA激活支架上培养5天后，免疫荧光染色显示脑组织深处的神经元也成功摄入了从支架释放的siRNA纳米粒子，证明了该平台在复杂三维组织中递送核酸药物的能力。
本研究成功开发并验证了一种多功能、可植入的“基因激活支架”平台，用于脊髓损伤修复。该平台的核心创新在于将非病毒GET-siRNA纳米粒子递送系统与生物相容性良好的透明质酸基组织工程支架相结合。研究结果表明：
- 1.
GET肽能高效、安全地将siRNA递送至多种类型的神经元，实现PTEN基因的特异性、短暂性沉默。
- 2.
PTEN的敲低有效激活了下游的PI3K/AKT/mTOR信号通路，并上调了与神经元存活和生长相关的基因（如Bcl-2和GAP-43）。
- 3.
负载siRNA的支架能长期保留并局部释放治疗性纳米粒子，有效转染种植其上的神经元，并在三维培养环境中延长基因沉默效果。
- 4.
在包含胶质细胞的复杂原代神经元培养模型中，PTEN-siRNA激活支架能显著促进损伤后神经元的神经突生长，且不引发额外的炎症反应。
- 5.
该平台甚至能够转染离体脑组织，证明了其在接近真实组织环境中的适用性。
这项研究的重大意义在于，它提供了一种协同解决脊髓损伤后轴突再生内外障碍的一体化策略。支架本身提供了引导轴突生长的物理结构和微环境（解决外部障碍），而携带的siRNA则精准调控神经元的内在生长状态（解决内部障碍）。这种将局部基因治疗与组织工程相结合的策略，为开发下一代治疗中枢神经系统损伤的先进植入物开辟了新途径，具有广阔的临床转化前景。
