基于GadBD304G/F433L突变体的全细胞生物催化剂高效合成γ-氨基丁酸

《Biochemical Engineering Journal》：Efficient Biosynthesis of γ-Aminobutyric Acid by a GadBD304G/F433L Mutant-based Whole- cell Biocatalyst

工程菌株E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB^D304G/F433L-gadC的构建及优化条件研究表明，通过单因素和正交实验优化反应条件（60°C，pH 3.2，15 g/L细胞生物量等）并结合五批次生物催化剂循环回收策略，GABA产量从单基因菌株的5.1 g/L提升至382.59 g/L。

　　

Fuyao Guan|Min Wu|Fei Tang|Xin Xu|Haoju Wang|Qihang Chen|Wei Sun|Huiru Cui|Jiahui Jiang|Hongguang Yang|Ping Yu|Min Chen

浙江工商大学食品科学与生物技术学院，中国浙江省杭州市交工路149号，310035

摘要

大肠杆菌中的内膜转运蛋白GadC可以促进谷氨酸的吸收和γ-氨基丁酸（GABA）的排出。基于先前构建的谷氨酸脱羧酶突变体GadB^D304G/F433L（具有更宽的pH适应性和增强的活性），该突变体在E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB^D304G/F433L中表达，本研究将gadC克隆到质粒pETDuet-1-gadB^D304G/F433L中，构建了重组菌株E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB^D304G/F433L-gadC。全细胞生物催化实验显示，单基因菌株的GABA产量为5.1克/升，而双基因（gadB^D304G/F433L-gadC）菌株的GABA产量为2.3克/升。通过单因素和正交实验优化生物催化条件（60°C、pH 3.2、15克/升细胞生物量、0.75毫摩尔L-谷氨酸钠、0.2毫摩尔PLP）后，GABA产量显著提高至54.84克/升。最终，通过实施全细胞生物催化剂回收策略，从谷氨酸钠中高效合成了382.59克/升的GABA。本研究为利用工程菌株E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB^D304G/F433L实现GABA的工业化生产提供了依据。

引言

γ-氨基丁酸（GABA）是一种四碳非蛋白质氨基酸，在自然界中广泛存在，目前被认为是人类中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质。它具有多种生理功能，包括预防失眠[1]、抗抑郁作用[2]、抗癌特性[3]和抗糖尿病活性[4],[5],[6]，在功能食品和制药工业中具有显著的应用潜力[7]。目前的GABA生产技术主要包括化学合成、植物富集[8],[9],[10]和微生物合成[11]。其中，微生物合成由于其安全性和效率方面的优势，已成为大规模工业生产的一种特别有前景的方法。用于GABA微生物转化的菌株包括Corynebacterium glutamicum、乳酸菌（LAB）和大肠杆菌。作为经典的模式生物，大肠杆菌具有明确的遗传背景、成熟的分子操作系统和较短的生长周期，因此成为生产GABA的主要菌株。

目前微生物合成GABA的方法主要包括传统发酵和全细胞生物催化。在发酵过程中，通过代谢工程改造可以显著提高GABA的生产效率。在我们实验室之前的研究中，构建了工程菌株E. coli BL21(DE3)/pet32a-gadABC [12]、E. coli ZGK12-TPE/pTrc99a-gadABC [13]和E. coli BL21(DE3)/pET28a- gadA-SNO1-SNZ1 [14]，这些菌株均有效提高了GABA的生产能力。与传统发酵相比，使用静止细胞将L-谷氨酸（L-Glu）或L-谷氨酸钠（L-MSG）转化为GABA具有转化效率高、反应时间短、产物分离和纯化简单以及工艺安全等优点[15],[16]。此外，在全细胞环境中，GAD更稳定，不易失活，且全细胞易于回收和重复使用[17]。在pH控制策略下，Lactobacillus brevis TCCC 13007的发酵产率为38克/升，生产速率为0.576克/升/小时。而全细胞生物催化将GABA的生产速率显著提高至1.520克/升/小时，最终浓度达到61克/升[15]。通过优化全细胞生物催化条件，GABA产量进一步提高至201.18克/升，生产速率为20.118克/小时[16]。采用补料分批操作，Enterococcus faecium GZ2的全细胞生物催化实现了41.88克/升的GABA产量和3.49克/升/小时的生产速率[18]。此外，冷冻处理可以增强细胞膜通透性，从而进一步提高GABA的产量。将大肠杆菌细胞在-20°C下处理10个周期后用于GABA生产，其产量提高了850克/升[19]。

GABA的生物合成途径主要由GAD调控，GAD是一种依赖于吡哆醛5'-磷酸（PLP）的酶，可催化L-Glu的α-脱羧生成GABA[20],[21],[22],[23],[24]。GABA的细胞内合成可以通过GadC反转运蛋白的作用运输到细胞外[11],[25]。野生型微生物菌株的GAD内源性表达水平和催化活性较低，在酸性条件下表现最佳，但在中性pH下活性迅速下降[26]。在GABA合成过程中，GAD介导的脱羧作用会逐渐消耗H?，从而提高环境pH值。当系统接近中性时，这种自催化的pH变化最终会使GAD失活，从而限制了反应的完整性[27]。为了解决这些问题，我们实验室通过定向进化和高通量筛选获得了工程突变体GadB^D304G/F433L[28]。这种突变策略成功提高了催化效率和pH适应性，与野生型GAD相比有显著改进。

在本研究中，将编码内膜转运蛋白gadC引入重组菌株E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB^D304G/F433L中，并通过全细胞生物催化L-MSG研究了两种工程菌株的GABA合成效率并进行比较。随后进行了单因素实验，优化了细胞密度、L-MSG浓度、PLP浓度、初始pH值和反应温度。通过正交实验设计进一步确定了最佳的全细胞生物催化条件。最后测量了催化反应的时间进程曲线，并回收了全细胞生物催化剂，以经济高效地提高GABA的产量。

细菌菌株、质粒和试剂

实验中使用的所有菌株和质粒列于表1中。本研究使用的所有引物序列见表2。E. coli BL21(DE3)、E. coli K12和E. coli DH5α购自美国Invitrogen公司。E. coli BL21作为目标基因表达的起始菌株。E. coli DH5α作为重组质粒扩增的宿主细胞。E. coli K12作为目标基因扩增的起始菌株。

重组质粒的验证

重组质粒双酶切验证结果如图1(a)所示。第1和2条泳道代表重组pETDuet-1 -gadB^D304G/F433L质粒的双酶切对照，而第3和4条泳道显示了选定的阳性克隆的双酶切产物。对照泳道1和2中观察到一条与预期大小6821 bp相符的明显条带。相比之下，阳性克隆（第3和4条泳道）的酶切产物显示出两条明显的条带：

讨论

利用全细胞生物催化剂合成高价值化学品已成为研究热点。由于大肠杆菌具有明确的遗传背景、先进的代谢工程工具和可扩展的发酵工艺，它已成为最广泛使用的全细胞生物催化剂[32],[33],[34]。目前提高全细胞生物催化中γ-氨基丁酸（GABA）生产效率的策略主要集中在工程菌株的开发上

结论

在本研究中，构建了工程菌株E. coli BL21(DE3)/pETDuet-1 -gadB^D304G/F433L-gadC，以研究GadC表达对GABA合成的影响。然而，GadC的表达增加了宿主的代谢负担，导致关键酶GadB的表达水平下降。结果，全细胞生物催化剂的GABA产量仅为原始菌株的45.1%。通过单因素和正交实验

CRediT作者贡献声明

Huiru Cui：方法学、数据分析。Jiahui Jiang：方法学、数据分析。Wei Sun：方法学、实验研究。Fei Tang：方法学、实验研究。Xin Xu：方法学、实验研究。Haoju Wang：方法学、实验研究。Qihang Chen：方法学、实验研究。Hongguang Yang：方法学、数据分析。Ping Yu：写作——审稿与编辑、撰写——初稿、资金获取、概念构思。Min Chen：方法学、数据分析。Fuyao Guan：方法学，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国浙江省自然科学基金（编号LY21C200006）的支持。