《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：NADPH oxidase 5 promotes adhesion and infiltration of immune cells in the brain. Implications in ischemic stroke
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本研究聚焦NADPH氧化酶5（NOX5）在缺血性脑卒中中对血脑屏障（BBB）破坏及免疫细胞浸润的调控机制。通过体外内皮细胞模型和内皮特异性NOX5敲入小鼠模型，发现NOX5通过NF-κB通路破坏紧密连接蛋白（ZO-1/CD31），诱导细胞骨架重构，显著增强免疫细胞黏附与跨内皮迁移。在FeCl3诱导的脑卒中模型中，NOX5促进非梗死区免疫细胞浸润并激活促炎标志物，为靶向NOX5调控神经炎症提供了新策略。
脑卒中作为全球致残和致死的主要病因之一，其病理机制复杂，其中缺血性脑卒中占所有脑卒中病例的绝大部分。血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）作为保护大脑微环境的重要结构，在脑卒中发生时会出现功能紊乱，导致免疫细胞浸润和炎症反应加剧，进而加重脑组织损伤。尽管目前对脑卒中的治疗取得了一定进展，但如何有效控制血脑屏障破坏及后续神经炎症仍是未解决的难题。近年来，NADPH氧化酶家族（NOX）因其在产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）和调控炎症反应中的关键作用受到广泛关注。其中，NOX5作为该家族中较晚被发现的成员，因其在啮齿类动物中天然缺失，相关研究相对有限，但其在人类血管疾病中的潜在作用逐渐显现。已有研究表明NOX5可能通过氧化应激参与内皮功能紊乱，但其在脑卒中血脑屏障破坏和免疫细胞浸润中的具体机制尚不明确。为此，来自西班牙纳瓦拉健康研究所的研究团队在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》上发表论文，系统探讨了NOX5在缺血性脑卒中中的作用机制。
本研究综合运用了腺病毒载体介导的NOX5过表达技术（在hCMEC/D3人脑微血管内皮细胞系和HUVEC人脐静脉内皮细胞中实现）、内皮特异性NOX5敲入（knock-in）小鼠模型、FeCl3诱导的缺血性脑卒中动物模型，以及免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术、细胞通透性实验、免疫细胞共培养黏附和迁移实验等关键技术方法。
3.1. NOX5过表达促进人脑微血管内皮细胞中内皮连接失调和通透性增加
研究人员首先在hCMEC/D3细胞中通过腺病毒载体过表达NOX5，发现其可导致紧密连接蛋白ZO-1的蛋白水平显著降低（24小时），但mRNA水平反而上调，提示可能存在转录补偿机制。同时，内皮连接蛋白CD31的蛋白表达也随NOX5过表达而下调。这些变化伴随内皮细胞旁路通透性显著增加，表明NOX5通过破坏内皮连接增强了血脑屏障通透性。进一步实验显示，在模拟缺血再灌注（离子霉素联合复氧处理）条件下，NOX5过表达细胞中ROS产生显著增加，且炎症刺激物LPS和血管紧张素II（Ang II）可上调内源性NOX5表达，提示NOX5在病理条件下可能被激活并参与血脑屏障破坏。
3.2. NOX5过表达在HUVEC中导致炎症细胞黏附和浸润增加
在HUVEC模型中，NOX5过表达引起细胞形态改变，出现"尖刺状"表型，细胞间连接松散，细胞圆形度下降，表明细胞骨架重构。分子机制上，NOX5上调细胞间黏附分子ICAM-1表达，下调CD31，并减少肌球蛋白轻链磷酸化，提示细胞收缩。这些变化与NF-κB信号通路激活相关：NOX5降低I-κB/NF-κB比率，促进NF-κB核转位。功能实验显示，NOX5过表达显著增强HL-60-GFP-CXCR2细胞（中性粒细胞样细胞）的内皮黏附以及THP-1细胞（单核细胞）的跨内皮迁移，且这一效应可被NF-κB抑制剂PDTC部分逆转。
3.3. 内皮NOX5在健康小鼠体内改变内皮连接表达
利用内皮特异性NOX5敲入小鼠（NOX5CRE），研究发现其在非卒中状态下即可引起脑组织ZO-1蛋白水平降低，而CD31下调呈现性别特异性（主要发生于雄性小鼠），提示NOX5对内皮连接的调控在体内同样存在，且可能受性别因素影响。
3.4. 内皮NOX5增加脑内免疫细胞浸润
在FeCl3诱导的缺血性脑卒中模型中，虽然NOX5过表达未显著影响梗死体积，但NOX5CRE小鼠非梗死区（对侧半球）显示血脑屏障通透性增加（纤维蛋白泄漏增多）。流式细胞术分析发现，NOX5对免疫细胞浸润的调控具有性别差异性：雄性小鼠中CD11b+CD45high髓系细胞和CD8+T细胞浸润增加；雌性小鼠中虽Ly6Chigh单核细胞比例未变，但其活化标志物TLR4和CD80表达上调。在梗死区（同侧半球），NOX5过表达进一步增强了髓系细胞的促炎状态，表现为CD80和TLR4表达升高。
本研究通过多层次实验证实，NOX5通过NF-κB通路破坏内皮连接蛋白表达和细胞骨架稳定性，从而增加血脑屏障通透性和免疫细胞脑内浸润。在缺血性脑卒中背景下，NOX5的持续表达促进免疫细胞跨血管迁移并增强其促炎活性，这一机制在非梗死区尤为明显，提示NOX5可能通过调控神经炎症影响脑卒中远期预后。研究不仅深化了对NOX5在脑血管疾病中作用的理解，还为开发以NOX5为靶点的神经炎症干预策略提供了理论依据。值得注意的是，NOX5在人类中高度表达而在啮齿类中天然缺失，使得本研究采用的转基因模型更具临床相关性，为转化研究提供了重要平台。
