《Biomaterials Advances》：Immunomodulatory and pro-mineralizing effects of an injectable baicalein-loaded methacrylated gelatin hydrogel for vital pulp therapy
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本研究首先探究了baicalein（BA）的生物功能，随后开发了光交联的甲丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶，内含BA负载的羧基化多孔二氧化硅纳米球（MSNs-COOH-BA），用于活髓治疗。体外实验表明BA在1-20 μM浓度下对牙髓干细胞（DPSCs）无显著毒性，且促进矿化结节形成，抑制TNF-α、IL-1α和IL-6炎症因子释放。水凝胶经SEM/EDS表征显示孔隙结构，压缩强度提高，BA缓释可持续10天，且非细胞毒性。体内实验显示各组急性炎症反应在28天后显著降低。GelMA/MSNs-COOH-BA水凝胶在维持机械性能的同时提供持续的BA释放，抑制炎症并促进修复，具有作为活髓材料的潜力
Beatriz Ometto Sahadi | Igor Paulino Mendes Soares | Chloe Gifford | Caroline Anselmi | Pedro Henrique Chaves de Oliveira | Renan Dal-Fabbro | Maedeh Rahimnejad | Marcelo Giannini | Marco C. Bottino
巴西圣保罗州皮拉西卡巴市坎皮纳斯大学皮拉西卡巴牙科学院修复牙科学系
摘要
本研究首先探讨了黄连素（BA）的生物学功能，随后开发了一种光交联的甲基丙烯酸明胶（GelMA）水凝胶，该水凝胶含有载有BA的羧基化介孔二氧化硅纳米球（MSNs-COOH-BA），用于 vital pulp therapy（ vital pulp therapy 的缩写，指保持牙髓活力的治疗方法）。最初，对BA（1–20 μM）的细胞相容性、体外矿化结节形成（作为牙源性潜能的早期指标）以及对牙髓干细胞（DPSCs）和巨噬细胞的抗氧化/抗炎作用进行了测试。随后，制备了15%（w/v）的GelMA，其中含有10或20 mg/mL的MSN-COOH-BA。通过SEM/EDS分析了水凝胶的微观结构、化学成分以及压缩性、膨胀性、降解性和BA的释放情况。生物学评估包括DPSC的细胞相容性、在LPS刺激下或无LPS刺激下的早期矿化反应、巨噬细胞的细胞因子调节作用，以及体内大鼠皮下生物相容性。统计分析使用了ANOVA/事后检验（α = 5%）。结果显示，BA无细胞毒性（24小时后细胞存活率≥70%），在基础条件和炎症条件下均促进了矿化结节的形成，降低了细胞内ROS水平，并以剂量依赖性方式抑制了TNF-α、IL-1α和IL-6的产生。即使加入了MSN，GelMA仍保持了其多孔结构。尽管载有BA的MSN表现出一定的纳米球聚集现象，但增强了机械性能，其中20 mg/mL的MSN-COOH-BA相对于GelMA提高了杨氏模量和极限压缩强度，表现优于不含BA的MSN。含有MSN的水凝胶显示出较慢的膨胀速度和较少的酶促质量损失。BA在10天内逐渐释放，且释放物无细胞毒性（与对照组相比减少<30%）。在LPS刺激下，20 mg/mL的MSN-COOH-BA在DPSC中诱导了最高的21天矿化结节形成，水凝胶提取物减少了巨噬细胞产生的TNF-α和IL-1α。体内实验中，所有组在7天时都出现了急性炎症浸润，但在28天时显著减轻，不同组间没有差异。GelMA/MSN-COOH-BA水凝胶结合了持续的BA释放、机械完整性、细胞相容性、抗炎活性和早期促牙本质形成的细胞反应，显示出作为具有临床相关治疗特性的可注射生物材料的潜力，有助于保护牙髓活力并支持牙本质-牙髓复合体的内在修复和发育能力。
引言
龋齿是牙科实践中最常见的疾病之一，通常在晚期才被诊断出来，导致严重的龋洞[1]。在去除龋齿的过程中，医源性牙髓暴露的风险显著增加[1]，[2]。在这种情况下，直接进行牙髓封闭可能有助于刺激修复性牙本质的形成，并在修复材料与牙髓组织之间创建“生物屏障”[3]，[4]。这种策略属于 vital pulp therapy（VPT，即保持牙髓活力的治疗方法），是一种保守的方法，旨在在龋齿损伤或创伤性损伤的情况下支持牙本质-牙髓复合体的内在修复和发育[3]，[4]，[5]。
牙本质-牙髓复合体通过炎症和矿化过程的结合来应对损伤，两者之间的平衡对于保持牙髓活力至关重要[6]，[7]。修复性牙本质生成受到生物活性信号的控制，包括损伤后从牙本质基质释放的生长因子，以及临床可用牙髓封闭材料中释放的钙离子和氢氧根离子[7]，[8]，[9]。因此，直接牙髓封闭材料不仅应保护暴露部位，还应促进修复性牙本质的形成[2]，[3]，[4]，[5]。尽管氢氧化钙和矿物三氧化物聚合体（MTA）被广泛使用，但由于其腐蚀性，它们在持续控制炎症方面存在局限性，这突显了需要改进策略以积极支持牙髓的再生反应[10]，[11]，[12]。
为应对这些挑战，基于明胶的生物材料，特别是甲基丙烯酸明胶（GelMA），已成为开发新的VPT策略的有希望的平台[10]，[11]，[12]。GelMA是一种柔软、多孔、高度水合的水凝胶，具有可调的网络结构、细胞相容性和生物降解性[13]，[14]。将介孔二氧化硅加入GelMA可以增强其机械性能和成骨潜力[15]，[16]，同时提供药物储存能力，以实现生物活性物质的控制释放，适合用于可注射的生物活性牙髓封闭应用。
基于GelMA的药物储存能力，天然化合物因其抗炎和抗菌特性而受到关注，可作为局部输送的生物活性分子[17]，[18]，[19]。其中，黄连素（BA）具有抗氧化、抗炎和抗癌活性[20]，[21]，[22]。尽管BA的剂量依赖性毒性需要进一步研究，但研究表明它可以促进间充质干细胞的矿化，表明其在硬组织再生中的潜力[18]，[23]，[24]。为了优化其治疗效果并最小化细胞毒性，可以先将BA封装在介孔二氧化硅纳米球（MSN）中，这些纳米球可以防止化合物过早降解并实现可控的局部释放[25]，[26]。然后将这些载有BA的MSN加入GelMA基质中，形成一个生物相容且可注射的平台，用于VPT，提供持续的释放并增强在炎症环境中的抗炎活性。
基于这一理念，我们设计了一项两阶段研究。首先，在体外量化了BA的剂量效应，评估了细胞相容性、矿化和抗氧化/抗炎活性。其次，开发了一种光激活的GelMA水凝胶，其中嵌入了封装了BA的MSN，并对其进行了表征和生物学评估，作为潜在的牙髓封闭材料，研究了其药物释放和对牙髓干细胞的生物效应。这一策略旨在结合GelMA的可调性和生物相容性支架与BA的再生和抗炎特性，以支持VPT应用中的牙髓细胞的再生反应。
材料与方法
本研究分为两个阶段进行。首先，通过细胞毒性、矿化和抗炎试验评估了不同浓度的黄连素。其次，开发了一种光激活的甲基丙烯酸明胶（GelMA）水凝胶，其中含有载有BA的介孔二氧化硅纳米球（MSN），旨在结合GelMA的可调机械性能和生物相容性与BA的再生和抗炎效果
牙髓干细胞（DPSCs）与不同浓度BA接触的存活率
在所有时间点，阳性对照组显示出最低的细胞存活率。第1天，20 μM浓度的BA处理（BA 20 μM）导致细胞相容性显著下降（p = 0.0028），与阴性对照组（p = 0.0261）和1 μM浓度的BA组（p = 0.0261）相比分别下降了21.08%和16.14%。在随后的时间点（第3天和第7天），未观察到统计学上的显著差异
讨论
本研究开发并表征了一种含有载有BA的二氧化硅纳米球的光交联GelMA水凝胶，评估了其细胞相容性、体外矿化相关反应和抗炎活性，用于 vital pulp therapy。在需要直接牙髓封闭的情况下，释放药物的水凝胶显示出强大的抗炎潜力，可以延缓甚至避免更侵入性的根管治疗[38]，[39]。由于它们的柔软性，
结论
总体而言，我们的结果表明，含有MSN-COOH-BA的GelMA水凝胶系统满足了 vital pulp-capping material（ vital pulp-capping material 的缩写，指用于保持牙髓活力的材料）的关键临床前标准。该系统在治疗相关的时间窗口内持续释放BA，同时保持了生物活性，减少了ROS和促炎细胞因子的产生，并促进了体外矿化结节的形成，这是牙源性潜能的早期指标，即使在LPS刺激下也是如此。BA的修饰增强了机械性能
作者贡献声明
Beatriz Ometto Sahadi：撰写初稿、方法学设计、研究实施、资金获取、数据分析、概念化。Igor Paulino Mendes Soares：撰写初稿、研究实施、数据分析。Chloe Gifford：撰写初稿、研究实施、数据分析。Caroline Anselmi：撰写与编辑、研究实施、数据分析。Pedro Henrique Chaves de Oliveira：撰写初稿、研究实施、数据分析、数据整理
伦理批准和参与同意
密歇根大学的机构动物护理和使用委员会批准了所有动物实验方案，这些实验均符合IACUC政策（PRO00012062）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）的支持：#2021/11972-0 和 #2023/09231-7。M.C.B. 感谢 美国国立卫生研究院（NIH）/国家牙科和颅面研究所（NIDCR）（资助编号 #R01DE031476）。内容仅代表作者个人观点，不一定代表美国国立卫生研究院的官方立场。
