通过新构建的重组大肠杆菌C165F-V231D对木质素衍生的丁香醛进行生物还原，高效合成丁香醇

《Bioresource Technology》：Efficient synthesis of syringyl alcohol through bioreduction of lignin-derived syringaldehyde by newly constructed recombinant Escherichia coli C165F-V231D

基于 Kluyveromyces polyspora 的 KpADH 变体 C165F-V231D 在 DMSO-H2O (5:95, V/V) 中高效催化丁香醛还原为丁香醇，得率达 99.7%。该变体通过定向进化结合晶体结构分析优化溶剂耐受性，解决了木质素衍生物芳香醛水相转化效率低的问题。

　　

李欣|柴浩宇|杨志凡|马翠銮|何宇才

湖北大学生物催化与酶工程国家重点实验室，武汉430062，中国

摘要

丁香醇是一种重要的木质素衍生的芳香醇，在香料和制药研究中有潜在的应用价值。在本研究中，它通过生物合成方法从丁香醛制备而成。表达来自Kluyveromyces polyspora的醇脱氢酶KpADH的重组大肠杆菌C165F-V231D实现了丁香醛的有效生物转化。基于对KpADH中165C到165F和231V到231D的突变研究，该变体在低浓度二甲基亚砜（DMSO）条件下表现出显著提高的催化活性。C165F-V231D在DMSO-H₂O（5:95, V/V）条件下的活性提高了1.9倍。最终，C165F-V231D细胞将25 mM的丁香醛转化为了丁香醇，分析产率为99.7%。这项工作为从木质素衍生的醛类化合物合成丁香醇提供了一种可持续的生物催化策略，有助于进一步开发木质素的增值利用和绿色合成生物芳香醇的方法。

引言

作为最丰富的可再生资源，木质纤维素是生物合成化学品、燃料和材料的重要原料（Kim等人，2023；Liu等人，2022；Neira等人，2018；Queneau和Han，2022）。丁香醛是一种从富含木质素的生物质中提取的芳香化合物，在香料和制药合成中具有重要作用（Wu等人，2022）。由丁香醛转化而来的丁香醇是一个典型的生物基平台（Jacobs等人，2023；Zhang和Wang，2020），在香料、制药中间体以及聚合物材料单体等领域有广泛的应用（Putra等人，2023；Sanchez等人，2024）。传统上，丁香醇主要通过化学合成和天然提取方法获得（Natte等人，2020；Sternberg等人，2024）。由于化学合成方法的产率低、效率低且不环保，生物转化被认为是一种非常有前景的替代方法（Panyadee等人，2021）。例如，DALE-22菌株在30°C下可将22.3 mM的丁香醛转化为18.7 mM的丁香醇，但转化时间长达96小时，表明其底物耐受性和生产力有限（Putra等人，2024）。这些结果表明，需要更活跃的生物催化剂来提高丁香醛向丁香醇转化的效率。

最近在木质素衍生芳香醛的生物催化转化方面取得了进展（Kumar Vaidyanathan等人，2023）。与呋喃醛不同，木质素衍生的芳香醛（如丁香醛）具有更强的疏水性，对全细胞生物催化剂有更强的抑制作用，使得在有机-水体系中的还原尤为困难。与木质素衍生的香兰素相比，丁香醛多了一个甲氧基，导致疏水性增加和空间位阻增大，进一步降低了底物的可及性，并加剧了溶剂诱导的抑制效应（图1a）。羰基还原酶（醇脱氢酶）是还原芳香醛为醇类的关键生物催化剂，但它们的活性和稳定性在有机体系中常常受到影响（Gu等人，2025）。在DMSO-H₂O（10:90, V/V）体系中，使用100 mM的香兰素作为底物时，产率达到了91.2%，比在水体系中提高了3.3倍（Zhang等人，2024；Zhang等人，2024）。这些发现表明，像DMSO–H₂O这样的有机溶剂混合物能够显著提高木质素衍生芳香化合物的生物催化转化效率（例如香兰素），显示出它们在处理难溶性芳香醛方面的潜力（Qi等人，2024）。然而，关于在含有机溶剂的体系中使用羰基还原酶还原木质素衍生芳香醛（如丁香醛）的系统研究仍然相对较少（Gu等人，2024）。

通过结合现有文献报道和对KpADH晶体结构（PDB ID: 5Z2X）的结构分析，筛选出了潜在的突变位点。优先考虑位于底物结合区域附近或暴露于溶剂中的残基，这些残基可能参与酶-溶剂相互作用；同时避免直接参与辅因子结合的残基，以尽量减少对催化机制的干扰。利用这种方法，获得了改进的KpADH变体（C165F-V231D），用于在DMSO-H₂O（5:95, V/V）条件下的催化反应。编码KpADH及其变体的基因被克隆并表达，构建了全细胞生物催化系统。在优化条件下，使用DMSO-H₂O（5:95, V/V）体系进行了丁香醛向丁香醇的生物转化。目前，关于高效生物还原丁香醛为丁香醇的研究仍然有限。本研究提供了一种在温和条件下从木质素衍生的丁香醛实现生物还原的方法。

部分内容摘要

化学品

葡萄糖、丁香醛（SYR）（>98%）、丁香醇（>98%）、DMSO、异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG，>99%）及其他试剂均来自中国上海的Aladdin Industries公司。

KpADH的定向突变与表达

使用重组表达载体pET28a-KpADH作为模板，对目标基因进行了定向突变，以引入特定的氨基酸替换。突变位点的选择基于现有文献报道和KpADH的结构分析（PDB ID: 5Z2X）。

构建表达醇脱氢酶KpADH及其变体的重组大肠杆菌

生物催化通常指的是利用酶或含酶的细胞来催化化学转化（Abdelraheem等人，2019）。近年来，生物催化技术在化学和制药领域取得了显著进展，这主要归功于催化酶种类的增加以及高通量实验室进化策略的进步（Bell等人，2021）。先前的研究已经表明...

结论

本研究建立了一种全细胞系统，用于木质素衍生的丁香醛向丁香醇的生物催化转化。工程改造后的C165F-V231D变体在DMSO-H₂O（5:95, V/V）条件下的催化效率显著提高。C165F-V231D细胞能够高效地将25 mM的丁香醛生物还原为丁香醇，分析产率为99.7%。这些结果表明，选择合适的工程改造...

未引用的参考文献

Aleku, 2024; Chio等人，2019; Gao等人，2025; Hao等人，2023; Semenov等人，2021; Shu等人，2021; Shu等人，2024; Yang等人，2021; Zhang等人，2022; Zhao，2020.

CRediT作者贡献声明

李欣：撰写初稿、方法学设计、数据分析、概念构思。柴浩宇：方法学设计、数据分析、数据整理、概念构思。杨志凡：监督工作、软件开发、数据分析。马翠銮：撰写与编辑、监督工作。何宇才：撰写与编辑、监督工作。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢江苏省前沿科技研发计划（BF2025080）和中国国家自然科学基金（项目编号：21978072）的支持。