《Bioresource Technology》：Targeted gene editing of bacterial cellulose biosynthesis-related genes enables programmable mechanical properties of bacterial cellulose
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细菌纤维素（BC）合成基因簇的基因组编辑与机械性能调控研究。基于突变pheS基因构建高效无缝基因组编辑系统，系统删除解吸四组bcs operon基因，发现bcsCII基因缺失使BC拉伸强度提升3.56倍，杨氏模量提高2.36倍，其结构优化源于纳米纤丝排列更均匀及三维网络致密化。通过诱导表达和共培养策略实现BC机械性能的可编程调控。
田艾天|高宏伟|安双琦|刘静轩|赵一鸣|常玉青|牛彦宁|贾彩峰|常中义|黄静|张强|蒋德明
华东师范大学生命科学学院，上海200241，中国
摘要
细菌纤维素（BC）是一种具有优异机械性能和广泛应用潜力的可持续生物材料。控制BC的结构和性能对其应用的扩展和工业转化至关重要。在这里，我们基于突变体pheS基因建立了一种高效、无缝的基因编辑系统，用于Komagataeibacter xylinus，并将其应用于系统评估细菌纤维素合成（bcs）操纵子基因在BC生产和性能中的作用。我们发现，删除bcsCⅡ基因显著增强了K. xylinus P1中的BC机械性能：抗拉强度和杨氏模量分别提高了3.56倍和2.36倍。多尺度结构分析表明，这种增强源于更均匀的纳米纤维组装和更密集的BC层次网络。我们进一步证明，共培养策略或bcsCⅡ的可诱导表达可以实现BC机械性能的可编程控制。总体而言，这项工作为K. xylinus提供了一个高效的遗传工具箱，系统揭示了bcs操纵子基因在BC组装中的功能作用，并为工程化高性能BC材料提供了合理途径。
引言
细菌纤维素（BC）是一种由微生物产生的天然聚合物，具有高纯度、结晶度、保水能力和机械性能（Quijano等人，2024年），这些特性支持其在生物医学、包装和电子领域的应用（Wu等人，2023年）。在产生BC的微生物中，Komagataeibacter属被认为是高产模型生产者（Lu等人，2020年）。BC的生物合成由膜嵌入的末端复合体（TCs）完成，这些复合体聚合并挤出葡聚糖链，最终形成三维纳米纤维网络（Girard等人，2024年）。
BC合成的遗传基础组织在细菌纤维素合成（bcs）操纵子中，这些操纵子在不同菌株之间存在冗余性和功能差异（Manan等人，2022年）。操纵子I包含BC生产所需的核心催化和分泌基因（bcsAB、bcsC）（Morgan等人，2013年；Omadjela等人，2013年），以及稳定TC复合体的bcsD和bcsH基因（Hu等人，2010年；Wiem Abidi等人，2022年；Sunagawa等人，2013年）。某些菌株还存在额外的操纵子（II–IV），这些操纵子以菌株特异性的方式影响BC产量、纤维形态和结晶度（R?mling和Galperin，2015年；Martin Bimmer等人，2022年；M. Bimmer等人，2023年；Peng等人，2025年）。总体而言，不同菌株间bcs操纵子的复杂性和多样性意味着单个bcs基因与BC性能之间的关系尚未得到充分解析。
由于长期以来缺乏高效的Komagataeibacter遗传工具，定义基因功能与BC性能之间关系的进展受到了限制。虽然已经开发了几种编辑系统，但每种系统都有其局限性。例如，Lambda Red/FLP-FRT系统不支持无缝删除（Liu等人，2020年）。尽管CRISPR/Cas9可以实现无缝编辑，但其应用范围仅限于有限的基因集（L. Huang等人，2025年）。CRISPR引导的碱基编辑虽然解决了基因失活和多重基因组编辑的问题，但可能不适合完全删除基因，并存在脱靶效应的风险（Xin等人，2025年）。基于SacB的逆选择系统受宿主特异性限制，需要SacB阴性的背景（Peng等人，2025年），而CodAB系统仅适用于特定菌株（Martin Bimmer等人，2022年；M. Bimmer等人，2023年）。因此，大多数研究仅针对单一菌株中的部分bcs基因，缺乏在统一遗传背景下对所有bcs基因位点进行系统和可比的筛选，并且很少测试编辑工具的通用性。
目前对bcs基因的研究主要集中在BC产量上，而对基因功能与BC纳米结构和材料性能（特别是对应用至关重要的机械性能）之间的关联关注较少（Ahmad等人，2024年）。目前调节机械性能的策略主要依赖于发酵优化或后处理（Li等人，2021年；Revin等人，2022年；Singhania等人，2022年）。然而，发酵存在可调性狭窄和可重复性问题的挑战（Wang等人，2023年），而后处理可能会引入缺陷并影响可持续性（Nú?ez等人，2024年）。这两种方法都缺乏可编程性和生物学一致性。相比之下，基因水平的调控直接针对BC合成和组装的内源途径，从而能够从分子合成到宏观结构形成进行精确干预。这种方法允许对机械性能进行可预测的、不受设备限制的控制，并与连续的生物制造过程相契合。最近在工程化活性材料（ELMs）方面的进展支持了这一范式（Caro-Astorga等人，2021年；Rodrigo-Navarro等人，2021年）。例如，与产生纤维素酶的酵母共培养以修改BC的物理性能（Gilbert等人，2021年），或使用CRISPRi下调galU基因以改变结晶行为（L. H. Huang等人，2020年）。然而，由于Komagataeibacter的遗传工具箱不完善，经过验证的遗传元件和位点仍然很少，工程驱动的性能改进也受到限制（Nú?ez等人，2024年）。
为应对这些挑战，我们开发了一种利用突变体pheS基因的K. xylinus的无缝基因编辑系统。我们构建了一个覆盖K. xylinus P1中所有四个bcs操纵子的单基因删除文库，从而能够系统评估基因对BC合成和性能的具体影响。我们发现，删除bcsCII显著增强了BC的机械性能。多尺度结构分析将这种改进与改变的纤维束组装和网络结构联系起来。此外，通过共培养和可诱导的基因表达，我们证明了BC性能的可编程定制。总体而言，这项工作加深了对BC生物合成机制的理解，并为开发高性能、可调的BC材料提供了有效的遗传工具和设计策略。
部分摘录
细菌菌株和质粒构建
本研究使用的所有菌株、引物和质粒均列在补充信息中。引物由BioSune Biotechnology（中国上海）合成。限制性内切酶来自Takara（日本）。DNA聚合酶和同源重组酶来自Yeasen Biotechnology（中国上海）。敲除质粒构建的同源臂和bcsCⅡ基因序列是从相关菌株的基因组DNA中扩增得到的。
K. xylinus的无缝基因删除系统的开发和验证
在产生BC的微生物中，Komagataeibacter因其高产量潜力、丰富的基因组注释和稳定的发酵特性而成为首选底盘（Sumini等人，2024年）。因此，我们选择了之前在我们实验室分离的高性能菌株K. xylinus P1进行后续研究。为了提供遗传工程的背景信息，我们首先分析了其bcs操纵子。全基因组注释在K. xylinus P1中鉴定出四个bcs操纵子。如图1A所示，与
结论
在这项研究中，我们开发了一种基于PheS逆选择的高效、无缝基因编辑系统，为Komagataeibacter的遗传工程提供了新的工具。利用该系统，我们对K. xylinus P1中所有四个bcs操纵子中的基因进行了系统的功能丧失筛选。筛选证实了操纵子I在BC合成中的核心作用，并且重要的是，揭示了删除操纵子II中的bcsCⅡ显著增强了BC的机械性能。
写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT来检查单词的拼写和语法错误。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容负全责。
CRediT作者贡献声明
田艾天：资源，项目管理。高宏伟：资源，项目管理，方法论，概念化。安双琦：验证。刘静轩：验证，调查。赵一鸣：验证。常玉青：验证。牛彦宁：资源。贾彩峰：资源。常中义：监督，资源，项目管理。黄静：监督，资源。张强：方法论，概念化。蒋德明：写作——审阅与编辑，监督，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
这项工作得到了上海自然科学基金（21ZR1419400）和华东师范大学公共创新平台（011）的支持。
术语表
- 细菌纤维素（BC）
- 一种由微生物产生的多糖，具有高纯度和结晶度，是本研究的主要研究对象。
- 细菌纤维素合成（bcs）操纵子/基因
- 指负责细菌纤维素合成的操纵子或基因。
- Brunauer–Emmett–Teller（BET）
- 一种基于气体吸附的分析技术，用于确定材料的比表面积和孔隙率。
- 化学定义培养基（CDM）
- 一种化学成分完全明确的培养基，用于
