通过透析控制硫基底物的释放，可以增强氧气胁迫条件下的硫自养反硝化作用

《Bioresource Technology》：Dialysis-controlled sulfur substrate delivery enhances Sulfur-Autotrophic denitrification under oxygen stress

硫自养反硝化（SAD）通过调控透析膜（1000和100 Da）实现硫代硫酸盐梯度释放，抑制溶解氧（DO>0.5 mg/L）干扰，100 Da组硝酸盐去除效率提升19%，硫氧化还原途径重组，电子分配至反硝化比例达76%，微生物群落分析显示硫氧化菌减少、耐氧硝酸盐还原酶丰度增加，证实动态释放可增强SAD抗DO能力。

　　

刘静宇|关慧泽|胡胜|卢慧峰|唐曦|唐崇健

中南大学冶金与环境学院，中国湖南长沙410083

摘要

硫自养反硝化（SAD）是一种利用还原态硫化合物作为电子供体的低碳氮去除工艺。然而，溶解氧（DO）会通过促进非生产性的硫氧化和电子损失来干扰SAD过程。本研究采用透析膜（分子量截留分别为1000 Da和100 Da）来调控硫代硫酸盐的释放，并在工程实际相关的抑制性DO条件下（0.5–3.5 mg L^?1）建立可控的基质梯度。与直接投加方法（R_ck）相比，100 Da孔径的透析膜反应器（R₁₀₀）实现了19%更高的硝酸盐去除效率，以及更大的电子分配比例用于反硝化反应（EDU_den ≈ 76%），同时伴随着明显的零价硫积累，表明发生了途径级别的电子重新分配。微生物分析显示，Thiobacillus类硫氧化反硝化菌的数量增加，且耐氧硝酸盐还原酶（napA）的丰度上升，这些结果通过宏基因组学和qPCR技术得到了验证。这些结果表明，可控的硫释放创造了电子缓冲的微环境，增强了SAD对DO的适应性，为在氧气波动的废水系统中高效去除氮提供了有效的策略。

引言

硫自养反硝化（SAD）作为一种生物氮去除技术具有广阔的应用前景。该过程利用还原态无机硫化合物（如硫化物、硫代硫酸盐、黄铁矿等）作为电子供体，这些物质比传统的碳源更丰富且成本更低（Wang et al., 2024）。此外，SAD工艺产生的污泥较少，温室气体排放也较低，符合中国的低碳排放政策（Kong et al., 2022, Wu, 2023）。研究表明，SAD系统在低温条件下表现优异（Li et al., 2020），与黄铁矿结合使用时效果更佳（Chen et al., 2023, 2023, 2023, 2023），并且在与厌氧氨氧化（anammox）耦合的集成系统中也能发挥作用（Wang et al., 2024）。然而，这些成功案例大多是在严格控制的低溶解氧（DO）或完全厌氧条件下实现的，而实际应用中难以维持恒定的厌氧环境（Kou et al., 2024a; Sun et al., 2023a）。许多基于反硝化的处理系统在厌氧或缺氧区域仍存在较高的溶解氧水平（>3.0 mg L^?1）（Sun et al., 2023b），这可能是由于混合不充分或进水中的溶解氧带入所致。因此，SAD系统经常面临工程实际相关的抑制性DO范围（0.5–3.5 mg L^?1）。这一问题尤为严重，因为从热力学和动力学角度来看，溶解氧会优先于硝酸盐（NO₃^?）作为电子受体（Chen and Strous, 2013, Ruan et al., 2020）。这导致溶解氧促进了非生产性的硫氧化，从而消耗了可用于反硝化的电子供体（Qambrani and Oh, 2013）。因此，了解SAD系统如何应对DO波动对于将这一技术从实验室成功应用于实际工程至关重要。

先前的研究表明，固相电子供体（SPEDs）可以在反硝化过程中缓解DO的抑制作用（Ma et al., 2023, Wu et al., 2024）。这类电子供体通常溶解度较低，能够以缓慢释放的方式提供电子，从而降低消耗速率并减少二次出水污染的风险（Chen et al., 2023, 2023, 2023, 2023, Sun et al., 2022）。一些混合型SPEDs，如聚（3-羟基丁酸-3-羟基戊酸）与锯末的复合材料（Yang et al., 2021）以及基于玉米芯的SPED（Liu et al., 2022），在处理低C/N比的废水时表现良好。然而，在SAD系统中，SPEDs在高DO条件下的有效性受到其固定且不可调节的释放动力学限制。一旦投入使用，SPEDs提供的电子供体流量无法快速适应动态的DO变化（Li et al., 2022）。此外，使用SPED通常需要将电子供体制成颗粒或珠状，这对许多设施来说并不方便。此外，多项研究表明，基于SPED的反应器中的微生物群落和功能基因谱与传统可溶性电子供体相比存在显著差异，这种群落变化会直接影响反硝化效率和途径选择（Chen et al., 2023, 2023, 2023, Sun et al., 2022）。最后，许多工业过程的废水（如脱硫液、采矿废水）中含有可作为低成本电子供体的溶解硫物种，但无法直接整合到固体基质中（Rappold and Lackner, 2010）。综上所述，尽管SPEDs可以缓冲电子供体的供应，但它们无法实现精细的控制，无法将硫氧化与氧气暴露分离，因此需要更具动力学可调性的电子供体传递策略。

具有明确分子量截留值（MWCO）的透析膜可以封装浓缩的电子供体，并通过扩散逐渐释放它们。这种方法类似于药物输送系统，通过调整膜孔径、供体浓度和表面积来精确控制释放速率（Yu et al., 2019）。小于MWCO的分子会根据浓度梯度、膜表面积和孔隙密度通过膜，而较大分子则被截留。通过选择合适的膜，可以实现可调节的释放动力学。据我们所知，这一原理尚未在废水处理中的电子供体传递领域得到系统研究。

我们假设，通过透析控制硫代硫酸盐的释放可以空间和动力学上解耦，从而增强SAD对DO的适应性。这可能通过三种机制促进反硝化：i) 位于膜表面的反硝化细菌在DO扩散并氧化硫代硫酸盐之前优先获取其资源；ii) 保持较低的硫代硫酸盐整体浓度可减少电子向DO介导的氧化损失；iii) 持续的低水平释放可能使反硝化过程在动力学上更具竞争力。为了验证这一假设，我们在SAD系统中使用了两种不同孔结构的透析膜（1000 Da和100 Da MWCO），并在逐渐增加的DO条件下（0.2至3.5 mg L^?1）将其性能与直接投加硫代硫酸盐的方法进行了比较。研究了去除效率、电子利用情况和硫的形态变化，以评估释放动力学对SAD性能的影响。此外，我们还分析了微生物群落组成和功能基因的丰度，以确定可控释放是否选择性地富集了反硝化菌群而非硫氧化菌群。本研究揭示了电子供体传递策略如何在氧气胁迫下影响SAD，并为那些无法可靠维持厌氧条件的系统提供了低碳氮去除的设计思路。

实验设置与操作

硫代硫酸盐静态释放实验：为了表征透析膜的硫代硫酸盐释放动力学，两个1 L的烧杯各加入1 L的超纯水。精确称量1.0 g的Na₂S₂O₃，然后将其装载到预处理的100 Da和1000 Da透析膜中。透析膜的预处理步骤详见文本S1。之后将膜放入烧杯中。在1、2、3、4、6、8、10和12小时时，分别抽取5 mL上清液。

无微生物影响的Na₂S₂O₃控制释放动力学

利用100 Da和1000 Da透析膜，绘制了Na₂S₂O₃的释放曲线（见图1a）。结果表明，100 Da透析膜能够持续释放Na₂S₂O₃超过8小时，而1000 Da透析膜的释放周期为4–6小时。这种延长的释放特性表明，透析膜中的Na₂S₂O₃具有缓释特性。与直接投加方法相比，两种方法的动力学差异明显。

结论

通过透析控制的基质传递（R₁₀₀）在氧气干扰（DO高达3.5 mg L^?1）条件下仍能维持稳定的反硝化过程，硝酸盐去除效率（NRE）达到78%。R₁₀₀的硫酸盐生成效率（SPE）也为92%，表明电子损失主要发生在非反硝化方向的硫氧化途径。R₁₀₀中明显的零价硫积累反映了硫氧化途径利用和反应动力学的变化，而不仅仅是简单的硫氧化抑制。

作者贡献声明

刘静宇：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念化。关慧泽：可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据分析。胡胜：验证、方法学设计。卢慧峰：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、实验设计、数据分析。唐曦：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督。唐崇健：撰写 – 审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（U21A20294）、湖南省重大科技创新项目（2024QK3001）以及湖南省科技创新领军人才计划（2024RC1012）的支持。