基于M13噬菌体展示的纳米体与MnO?纳米酶结合物的三信号侧向流免疫测定法，用于检测牛酪蛋白

《Biosensors and Bioelectronics》：Triple-signal lateral flow immunoassay for the detection of bovine casein using an M13 phage-displayed nanobody and MnO 2 nanozyme conjugate

牛奶过敏检测中开发了一种基于M13纳米抗体和二氧化锰纳米片的三重信号侧流免疫层析法，实现快速灵敏检测，检测限低至6.72 ng/mL，准确回收率87.92%–114.25%，适用于食品现场检测。

　　

董文毅|尤阿娟|邱玉楼|刘婉婉|邱佳|朱宇涛|张彪|傅贤树|叶志宏|余晓萍

中国计量科学研究院微生物计量、测量与生物产品质量安全重点实验室，国家市场监督管理总局，浙江理工大学，杭州，310018，中国

摘要

牛奶过敏是一个全球性的健康问题，其中牛酪蛋白被认为是主要的过敏原。因此，快速、灵敏且准确地检测食品中的牛酪蛋白至关重要。本文开发了一种三信号侧向流动免疫测定（LFIA）方法来检测酪蛋白，该方法结合了M13噬菌体展示的纳米体（M13-Nb）和多功能MnO₂纳米片（MnO₂ NSs）作为信号探针。通过四轮生物淘选，从原始噬菌体展示纳米体库中筛选出了抗酪蛋白的M13-Nb。具有内在比色特性、类氧化酶催化活性和光热能力的MnO₂ NSs与M13-Nb结合，使得基于MnO₂ NSs@M13-Nb的LFIA能够同时产生比色、放大比色和光热信号。这些模式的检测限（vLOD）分别为125、15.63和31.25 ng/mL，相应的定量限（LOD）分别为60.97、6.72和23.88 ng/mL。该测定方法表现出高特异性和准确性，在添加了酪蛋白的食品样本中的回收率为87.92%–114.25%。这种三信号LFIA为食品中酪蛋白的检测提供了一个快速可靠的平台，并展示了结合M13-Nb和MnO₂ NSs进行食品过敏原现场监测的潜力。

引言

食物过敏是一个严重的全球公共卫生问题，估计成人中的患病率为5%，儿童中为8%，并且其发病率持续上升（Ballegaard和B?gh 2023；Pantazi等人2023）。牛奶被联合国粮食及农业组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）列为八大主要致敏食物之一，是常见的过敏原。牛奶过敏（CMA）会引起不良的免疫反应，影响皮肤、胃肠道和呼吸系统，产生呕吐、红斑、荨麻疹、水肿、嗜睡和哮喘等症状（Silva等人2020；Yang等人2022）。目前尚无根治牛奶过敏的方法，严格避免接触过敏原仍是预防不良反应的主要策略。牛奶蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，其中酪蛋白约占牛奶总蛋白的80%，是导致CMA的主要过敏成分（Choi等人2011）。此外，酪蛋白具有较高的热稳定性，在常规食品加工后仍保持其致敏性（Villa等人2022）。这些特性凸显了需要快速、准确和现场检测食品中酪蛋白的方法。

现有的酪蛋白检测分析技术包括质谱法（Lu等人2023）、液相色谱-串联质谱法（Hostetler等人2021；Pavón-Pérez等人2025）、酶联免疫吸附测定（ELISA）（Tan等人2024）、表面等离子体共振（Indyk等人2021）和电化学传感器（Jiang等人2019）。尽管这些方法具有高灵敏度和准确性，但它们需要复杂的操作程序、较长的分析时间和专用仪器，不适合快速现场检测。相比之下，侧向流动免疫测定（LFIA）具有简单性、快速性和高通量，适用于现场测定目标分析物（Di Nardo等人2021）。LFIA在快速估计目标浓度和提供早期预警方面发挥着重要作用。制备高亲和力抗体是建立LFIA的关键（Wu等人2019）。然而，传统的抗体生产方法受复杂程序、长生产周期、大规模制备困难以及批次间差异的影响（Yang等人2025；Yang等人2023）。

纳米体（VHHs或Nbs）来源于骆驼科动物重链抗体的可变结构域，是已知最小的抗体片段，仅包含三个互补决定区（CDRs）（Gao等人2025；Muyldermans 2021）。它们的独特结构赋予了高溶解度、高稳定性和易于表达的特点，以及适合基因操作的特性（Asaadi等人2021；Hu等人2024）。与传统抗体相比，纳米体可以在1-2周内从噬菌体展示的纳米体库中筛选出来。M13噬菌体展示的纳米体（M13-Nb）结合了M13噬菌体和纳米体的优点：纳米体与M13噬菌体的次要外壳蛋白（pIII）融合，实现了特异性目标识别；而大约2700个主要外壳蛋白（pVIII）的拷贝则作为酶或纳米材料的载体，有助于信号放大（Liu等人2025；Wang等人2023）。由于这些特性，纳米体越来越被视为有前景的亲和试剂类别。据我们所知，尚未有专门针对牛酪蛋白的纳米体报道。

信号输出是LFIA开发中的另一个关键考虑因素。传统的基于金纳米颗粒（AuNP）的比色平台操作简便且易于观察，但通常灵敏度和准确性有限（Fang等人2025）。近年来，具有酶模拟活性的纳米材料（如金属基纳米酶、金属氧化物、金属硫化物和碳基材料）受到了广泛关注（Ai等人2021；Liu等人2021）。通过结合酶活性和独特的物理化学特性，纳米酶表现出高催化效率、稳定性、低成本和可调结构（Yang等人2021）。这些优点使它们适用于传感应用，并为提高LFIA性能提供了机会（Shu等人2022；Yang等人2024）。其中，二维MnO₂纳米片（MnO₂ NSs）因其高比表面积、生物相容性、光学特性、类氧化酶活性和光热能力而成为值得注意的多功能信号标记物（Sohal等人2021）。它们本身的棕色支持直接比色读数。此外，MnO₂ NSs能高效催化3,3′,5,5′-四甲基苯胺（TMB）的氧化，生成蓝色的氧化TMB（oxTMB），无需外加过氧化氢（H₂O₂），从而放大比色信号。MnO₂ NSs与oxTMB结合还能产生协同的光热效应，产生互补的光热信号。多信号LFIA策略减少了干扰，提高了检测准确性，并支持具有可调灵敏度的多维定量分析（Huang等人2023；Zhang等人2023）。

在这项研究中，我们使用M13-Nb和MnO₂ NSs开发了一种三信号LFIA来检测牛酪蛋白（方案1）。从原始纳米体库中筛选出针对酪蛋白的特异性纳米体。合成了具有比色、催化和光热特性的多功能MnO₂ NSs，并将其与M13-Nb结合以制备检测探针。这些探针能够产生比色、放大比色和光热信号。评估了基于MnO₂ NSs@M13-Nb的三信号LFIA的分析性能，并将其应用于实际食品样本。所开发的平台为食品中酪蛋白的快速灵敏检测提供了一种可靠的方法。

试剂和仪器

来自羊驼的原始纳米体库、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗M13多克隆抗体（pAb）和抗M13 pAb购自AlpVHHs有限公司（成都，中国）。抗酪蛋白pAb购自BioLab有限公司（北京，中国）。牛酪蛋白（目录号C3400）和TMB购自Sigma-Aldrich（上海，中国）。氢氧化四甲铵（TMAH）、H₂O₂、聚山梨酯20（Tween-20）和氯化锰（MnCl₂）购自Aladdin生化公司

酪蛋白特异性噬菌体展示纳米体的淘选和鉴定

经过四轮生物淘选后，噬菌体滴度从第一轮的1.17 × 10⁶ pfu增加到第四轮的2.18 × 10⁸ pfu，表明酪蛋白特异性噬菌体得到了186倍的富集（图1A）。从最终轮次的滴定平板中随机选择了48个噬菌体克隆，并通过噬菌体ELISA进行筛选。如图1C所示，24个克隆显示出对酪蛋白的特异性结合，其在450 nm处的光密度值（OD450）比阴性对照高三倍以上

结论

在这项研究中，我们使用M13-Nb和MnO₂ NSs开发了一种三信号LFIA来检测牛酪蛋白。从原始纳米体库中筛选出具有高结合亲和力的抗酪蛋白M13-Nb作为识别元件。具有比色特性、催化活性和光热能力的MnO₂ NSs被用作多功能标记物，以产生比色、放大比色和光热信号。这些信号模式的结合提高了检测的准确性

CRediT作者贡献声明

董文毅：撰写——原始草稿、方法学、数据管理。邱玉楼：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、方法学、概念构思。尤阿娟：方法学、数据管理。余晓萍：监督、资源提供。叶志宏：实验研究。傅贤树：数据可视化。邱佳：实验研究。刘婉婉：方法学。张彪：验证。朱宇涛：软件开发

未引用参考文献

Akkerdaas等人，2004；Liu等人，2024。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（2022YFF1101000）和浙江省自然科学基金（LMS25C200001）的支持。