选择最佳路径：通过CRISPR/Cas9靶向TaARE1-D优化小麦转化方法以提升产量的比较研究

《PLOS One》：Choosing the best route: Comparative optimization of wheat transformation methods for improving yield by targeting TaARE1-D with CRISPR/Cas9

本研究通过系统优化农杆菌（Agrobacterium）介导的未成熟胚转化、愈伤组织转化和注射式原位（in planta）转化三种方法的参数，将小麦（Triticum aestivum L.）遗传转化效率提升至传统报道（约3%）的十倍以上。核心创新包括缩短未成熟胚的愈伤组织诱导阶段，将再生时间减少约一个月，并成功利用CRISPR/Cas9敲除了氮吸收与产量的负调控基因TaARE1-D。获得的突变体表现出穗粒数、穗长、粒长和千粒重增加，以及与之相关的滞绿表型。优化后的方案为加速基于基因编辑的小麦产量与胁迫耐受性改良提供了稳定平台。

　　

优化小麦转化：迈向高产与耐逆育种的新路径

小麦是全球最重要的主粮作物之一，为世界人口提供了大量的热量和蛋白质。然而，利用基因编辑技术改良小麦性状面临一个主要瓶颈：其遗传转化和植株再生效率低下，这极大地限制了CRISPR/Cas9等精准育种工具的应用潜力。为了突破这一限制，本研究对三种主流的农杆菌介导转化方法——未成熟胚转化、成熟胚来源愈伤组织转化以及注射式原位转化——进行了系统性参数优化，旨在建立高效、快速的转化与再生平台，并以高产相关基因TaARE1-D的敲除作为验证。

核心优化策略与效率突破

研究团队首先对转化过程中的多个关键参数进行了精细调整，包括农杆菌菌株、细菌密度（OD₆₀₀）、乙酰丁香酮（acetosyringone）浓度以及共培养条件。在三种测试的菌株（AGL1, EHA105, GV3101）中，携带pSOUP辅助质粒的AGL1菌株在所有转化方法中均表现最佳，这归因于其与小麦组织更好的相容性和更高效的T-DNA递送能力。

对于未成熟胚转化，最优条件确定为使用AGL1菌株，OD₆₀₀=0.8，接种和共培养培养基中添加150 μM乙酰丁香酮，浸泡时间为15分钟。在此条件下，转化后能够在含潮霉素（hygromycin）的选择培养基上存活的未成熟胚比例高达66.84%。

对于成熟胚来源的愈伤组织转化，最佳参数略有不同：同样使用AGL1菌株，OD₆₀₀=0.8，但将接种时间缩短至10分钟，乙酰丁香酮浓度仍为150 μM。此方案实现了55.44%的转化效率。

关键的流程革新体现在对未成熟胚转化方案的改进。传统方法需要长达4-6周的愈伤组织诱导和筛选期，而本研究将未成熟胚在含筛选压力的愈伤组织诱导培养基上仅培养两周后，便直接转入添加了0.2 mg/L 吲哚-3-乙酸（IAA）的再生培养基。结果发现，IAA在促进小麦愈伤组织（无论是未成熟胚还是成熟胚来源）再生方面，效果显著优于1 mg/L的玉米素（zeatin）。这一调整将整个转化再生流程缩短了约一个月，而转化效率并未降低。

原位转化：一条绕过组织培养的快速通道

传统的转化方法依赖繁琐的组织培养。作为一种替代方案，本研究优化了一种注射式原位转化方法。该方法将农杆菌悬浮液直接注射到小麦幼苗的顶端分生组织，旨在绕过愈伤组织诱导和再生步骤。

通过优化，确定最佳条件为：使用AGL1菌株，OD₆₀₀=1.0（更高的细菌密度有利于在无富营养条件下实现有效转化），接种液中含150 μM乙酰丁香酮，注射后将幼苗在黑暗中培养两天。优化后，通过PCR筛选鉴定的阳性植株比例达到33.33%，相比早期报道的约3%的效率实现了显著提升。尽管其绝对效率仍低于基于组织培养的方法，但原位转化以其操作简便、周期短的优点，为快速获得编辑植株提供了有前景的替代路径。

基因编辑验证：靶向高产负调控因子TaARE1-D

为验证优化后转化平台的有效性，研究选择了一个已知的高产负调控基因——TaARE1-D 作为靶点。该基因是水稻ARE1基因的小麦同源基因，其功能缺失已被证明能提高氮吸收效率，导致穗长增加、衰老延迟和粒重提升。

利用构建的CRISPR/Cas9载体，通过上述三种优化方法成功获得了TaARE1-D的敲除突变体。分子检测表明，所有方法均能产生有效的基因编辑事件，突变类型包括缺失和插入。例如，通过未成熟胚转化获得的IM33株系在gRNA1和gRNA2靶点分别发生了8 bp和4 bp的缺失；通过愈伤组织转化获得的MC7株系在两个靶点均发生了2 bp缺失；通过原位转化获得的IP5株系在gRNA2靶点发生了1 bp缺失。测序分析证实，这些突变可以稳定遗传给T₁代。

表型分析：编辑植株的产量提升

对代表性突变株系（IM33, MC7, IP5）与非编辑对照品种Kayra进行的表型比较显示，所有TaARE1-D功能缺失突变体均表现出显著的产量相关性状改良：

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  穗粒数：从对照的57.5粒显著增加至63.2-65.0粒。
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  穗长：从9.47 cm增加至10.18-10.33 cm。
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  粒长：从6.69 mm增加至7.46-7.91 mm。
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  千粒重：从40.51 g增加至43.09-43.77 g。

此外，突变体还表现出典型的滞绿表型，即叶片衰老延迟，这与TaARE1-D功能缺失的已知特征一致。这些结果一致表明，通过优化的转化方法成功敲除TaARE1-D，能够有效提高小麦的产量潜力。

讨论与展望

本研究通过系统性优化，将小麦遗传转化效率提升了一个数量级，并显著缩短了获得编辑植株的时间。其中，基于组织培养的方法（未成熟胚和愈伤组织转化）实现了高效率和高再生率，而原位转化方法则为快速、无需组织培养的基因递送提供了可行方案。这些优化方案共同构成了加速小麦基因编辑育种的有力工具。

当然，研究也存在局限性，例如所有优化均在单一春小麦品种Kayra上进行，而不同基因型对转化的响应可能存在差异。因此，未来需要在更多品种，特别是优良栽培种中验证和调整这些参数。尽管如此，本研究建立的高效转化框架，结合CRISPR/Cas9精准编辑技术，为快速开发具有更高产量、更好胁迫耐受性的新一代小麦种质资源奠定了坚实的技术基础，对应对全球粮食安全挑战具有重要意义。