基于钛的MXene材料的表面老化通过抑制细胞对这种材料的摄取及其反应性，从而减轻了其对线粒体的毒性作用

《Environmental Pollution》：Surface Aging of Ti-Based MXene Attenuates Mitochondrial Toxicity via Suppressed Cellular Uptake and Reactivity

两二维MXenes在氧化老化过程中表面形成TiO?层并发生聚集，导致细胞摄取减少、氧化应激降低和线粒体损伤缓解，证实老化可部分解毒Ti3C2和Ti3CN纳米片。

　　

张睿|李晓迪|刘玉娇|毛轩|魏永毅|王宇|周晓飞|贾建波

中国广州大学环境研究院，珠江三角洲水质与保护重点实验室，广州510006

摘要

二维MXenes材料，尤其是碳化钛（Ti₃C₂）和碳氮化钛（Ti₃CN），在从绿色能源存储到生物医学等多个领域的应用中引起了越来越多的关注。然而，在使用和处置过程中，这些材料不可避免地会暴露于水环境或生理环境中，从而导致氧化老化，可能改变其物理化学性质和生物效应。在本研究中，我们系统地比较了原始状态和老化状态下的Ti₃C₂和Ti₃CN MXenes在人结肠上皮细胞中的细胞毒性和作用机制。材料表征显示，老化过程促进了表面氧化、部分TiO₂的形成以及聚集现象，其中Ti₃C₂的变化更为明显。细胞实验表明，原始状态的MXenes（尤其是Ti₃CN）会导致线粒体肿胀、嵴结构破坏、溶酶体功能障碍、活性氧过量产生以及细胞凋亡。相比之下，老化状态的MXenes表现出较低的细胞摄取率、减弱的氧化应激和减轻的线粒体损伤，这与较低的细胞凋亡率相关。这些发现表明，氧化老化通过调节MXenes的表面反应性和亚细胞相互作用，起到了一种内在的解毒作用。本研究强调了在MXenes的安全评估中考虑环境因素的必要性，并为设计更安全、更具应用前景的二维纳米材料提供了机制上的见解。

引言

二维过渡金属碳化物和氮化物（统称为MXenes）因其高导电性、亲水性和可调节的表面官能团（如-O、-OH和-F基团）而受到广泛关注[1]。碳化钛（Ti₃C₂）及其氮化物类似物碳氮化钛（Ti₃CN）是研究最深入的MXenes之一，后者由于氮原子的引入而具有改性的电子结构和增强的边缘反应性[2, 3, 4]。除了组成不同外，Ti₃CN还表现出与Ti₃C₂不同的光电性能和稳定性特征。特别是X位点上的C/N原子比例变化会导致原子级别的无序或替代缺陷，从而降低电子导电性，并使紫外-可见光吸收峰向蓝侧移动[5]。这种替代缺陷化学性质还会增强MXenes的水解/氧化倾向，可能影响其在生物介质中的氧化还原行为[6]。这些特性使得MXenes适用于多种应用，如绿色能源存储、催化、电磁屏蔽以及生物传感、药物递送和光热疗法等生物医学领域[7, 8, 9, 10, 11]。

尽管MXenes具有广泛的应用前景，但其生物安全性和环境行为仍知之甚少[12, 13]。重要的是，当MXenes从实验室规模材料发展为实际应用形式（如油墨/涂层、复合膜和膜结构）时，其在整个生命周期中的环境释放成为可能[11]。潜在的释放途径包括制造和后处理过程中的排放物（尤其是含酸/氟的蚀刻和清洗液）、大规模生产过程中的工业排放、使用和再生/反冲洗过程中MXene涂层或膜的磨损/浸出，以及含MXenes产品的最终处置/回收，所有这些都可能导致MXenes或其转化产物进入水系统[14]。现有的毒理学研究表明，关键的材料属性（如组成、尺寸和表面化学性质）决定了它们的生物效应[15]。证据包括MXenes在不同组成下对人类细胞的细胞毒性[16]、尺寸依赖性的基因毒性[17]，以及表面修饰带来的抗氧化保护作用[18]。然而，所有这些研究主要集中在原始状态的MXenes上。一个更为关键且尚未充分研究的领域是MXenes的环境转化过程。例如，尽管有研究记录了Ti₃C₂纳米片对小鼠的生殖系统造成的毒性[19]，但转化或老化后的MXenes在生物系统中的行为和效应几乎未被探索。

为了安全使用MXenes，不仅需要了解其原始状态下的性质，还需要了解其在环境老化后的行为。在应用、储存或处置过程中，MXenes不可避免地会接触到水环境，在其中会发生复杂的转化，尤其是氧化反应[20]。这些过程可能导致表面形成富氧化物层、功能性官能团的丧失以及聚集[21, 22]。重要的是，这些转化的动力学和产物强烈依赖于具体环境条件：溶解氧、pH值、离子强度、光照以及氧化还原活性物质（如消毒剂或金属离子）可以加速或改变氧化和表面重构过程，而天然有机物和生物大分子则可以影响胶体稳定性和界面反应性。因此，理解MXenes的老化过程不仅需要记录氧化特征，还需要评估转化变化如何影响细胞摄取和细胞器层面的损伤机制。

最新研究表明，老化过程可能减轻或加剧毒性，这一动态在最近的MXenes研究中得到了明确体现。例如，在相同剂量下，水老化后的Ti₃C₂比原始状态下的MXenes更易被哺乳动物细胞耐受[23]，但V₂C MXenes的降解会因有毒的V₂O₅迅速释放而增强其毒性[24]。除了简单的水存储环境外，针对更接近实际应用环境或化学性质更复杂的条件进行的最新研究进一步表明，MXenes的转化具有高度的情境依赖性：Ti₃C₂T_x在氧气饱和的水中和中性pH值下的紫外照射下相对稳定，但在强氧化剂（如游离氯）或Fe(III)丰富的条件下会迅速转化，产生含TiO₂的产物并导致结构破坏[25]。此外，酶促氧化剂（如过氧化物酶/H₂O₂系统）也被报道可以催化MXenes的降解并生成TiO₂纳米颗粒，表明生物地球化学氧化过程可以改变MXenes在水环境中的命运[26]。这一现象在其他二维材料中也有所观察。例如，高氯酸盐和可见光对氧化石墨烯的老化作用增加了其聚集程度并改变了表面化学性质，从而增强了其对藻类细胞的毒性[27]。类似地，老化后的MoS₂纳米片通过释放酸性离子Mo物种显著降低了斑马鱼胚胎的存活率[28]。综上所述，MXenes的环境转化是其生物效应的主要决定因素，因此在实际老化条件下评估其安全性至关重要。

值得注意的是，尽管对Ti₃C₂和Ti₃CN的兴趣浓厚，但同时考虑细胞摄取、内吞作用、线粒体损伤、氧化应激和凋亡信号传导的系统性老化前/后比较仍然很少，因此尚不清楚碳化物与碳氮化物之间的化学差异及其相关反应性如何影响转化路径和下游细胞器层面的机制。在本研究中，我们系统地比较了原始状态和老化状态下的Ti₃C₂和Ti₃CN MXenes在水环境中的生物效应，特别关注它们与人结肠上皮（FHC）细胞的相互作用。我们使用紫外-可见光光谱、透射电子显微镜（TEM）、拉曼光谱（Raman）、X射线光电子能谱（XPS）、ICP-MS以及Annexin V/PI凋亡检测方法来评估它们的物理化学性质、细胞摄取、亚细胞定位、线粒体超微结构、活性氧生成和凋亡诱导方面的差异。结果表明，老化过程导致表面氧化和TiO₂的形成，从而降低了细胞摄取率，进而减轻了线粒体损伤、氧化应激和caspase介导的凋亡。这种解毒效应在Ti₃CN中尤为明显，表明老化可以作为一种自然的解毒途径，为未来设计更安全的MXenes和更现实的纳米材料安全评估提供了依据。

材料

MXene水悬浮液（1 mg/mL）购自中国苏州贝科纳米科技有限公司。这些悬浮液未经缓冲处理，直接使用未调节pH值的水进行老化实验；因此，在老化过程中未主动控制pH值。根据我们的定制要求新合成的MXenes被视为原始状态。老化后的MXenes（分别称为o-Ti₃C₂和o-Ti₃CN）是在4°C下密封储存90天制备的。

老化改变了Ti₃C₂和Ti₃CN的光学吸收和形态

首先在4°C的环境条件下研究了分散在去离子水中的Ti₃C₂和Ti₃CN的老化行为，持续时间最长为90天。通过紫外-可见光光谱监测了其降解过程。对于Ti₃C₂悬浮液，90天内吸收强度显著下降（图1A）。近红外区域的特征表面等离子体共振峰也出现了明显的蓝移。

结论

本研究表明，氧化老化通过改变MXenes的表面化学性质、细胞摄取和细胞器层面的相互作用，显著影响了它们的细胞毒性。原始状态的MXenes（尤其是Ti₃CN）表现出更强的细胞毒性，因为它们更容易被细胞内化、在溶酶体中积累，同时引起氧化应激和线粒体超微结构的损伤（嵴结构丧失和肿胀）。这些效应通过老化诱导的表面氧化得到了缓解。

CRediT作者贡献声明

贾建波：撰写、审稿与编辑、项目管理和资金申请。周晓飞：撰写、审稿与编辑、资金申请。刘玉娇：软件开发、方法学研究、数据分析。李晓迪：数据可视化、方法学研究、实验设计、数据分析。张睿：方法学研究、实验设计、数据分析、概念构思。王宇：结果验证、软件应用。魏永毅：初稿撰写、项目监督、方法学研究。毛轩：数据可视化、方法学研究、数据分析。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2023YFA0915102）、国家自然科学基金（22276042）以及河北省高等学校基本科研业务费专项（KY2023021）的支持。