通过表面展示冷适应型硝基还原酶来改造固定化微生物：一种在低温下高效降解硝基苯的策略

《Environmental Research》：Engineering immobilized microbes with surface-displayed cold-adapted nitroreductase: An efficient strategy for nitrobenzene degradation at low temperature

硝基苯低温高效降解技术研究中，通过表面展示技术将南极菌PsNTR固定于大肠杆菌外膜，结合改性硅藻土（DA-PEI/GA）固定化策略，构建了具有稳定表达和重复使用特性的工程菌株BL21/INPN-PsNTR。该系统在15℃、500 mg/L硝基苯浓度下实现120小时内92.75%的降解率，突破了传统酶法处理低温适应性差、酶回收难的技术瓶颈，为低温污染治理提供了创新解决方案。

　　

侯艳华|李玉洁|邹一帆|王亚彤|王全福

哈尔滨工业大学海洋科学与技术学院，威海，264209，中国

摘要：

硝基苯（NB）是一种典型的芳香族硝基化合物，由于其废水在低温环境下难以降解，因此成为了一种重要的污染物。本研究构建了一种经过工程改造的菌株，该菌株具有适应低温环境的硝基还原酶（PsNTR），以提高低温下的降解效率。研究采用了细胞表面展示系统，其中冰核蛋白（INPN）的N端结构域作为锚定载体。SDS-PAGE、Western blot分析和蛋白酶可及性实验证实，INPN-PsNTR融合蛋白（55.40 kDa）在大肠杆菌表面稳定表达并展示。工程菌株BL21/INPN-PsNTR在展示过程中保持了外膜完整性，并表现出强劲的生长能力。为了进一步提高工程菌株的储存稳定性和可重复使用性，研究人员使用改性的硅藻土（DA-PEI/GA）对其进行了固定。值得注意的是，PsNTR@DA-PEI/GA在低温下表现出高效的NB降解能力，在15°C条件下120小时内可将500 mg/L的NB降解92.75%。总之，本研究以PsNTR表面展示技术为核心策略，结合细胞固定方法，建立了一种新型且具有前景的技术途径，用于高效、绿色地降解低温下的硝基苯，为NB污染的治理提供了新的策略。

引言

硝基苯（NB）是一种典型的芳香族硝基化合物，在化工行业中广泛用于生产农药、燃料、炸药等产品（Guo等人，2023；Ju和Parales，2010）。然而，全球每年化学制造过程会产生并排放大量含有NB的废水（Fu等人，2025）。由于NB具有致癌、致突变和致畸风险，它已被广泛认为是优先污染物质（Wang等人，2022）。与传统处理NB废水的方法（如物理吸附、光催化氧化和电化学技术）相比，利用微生物和酶的生物方法具有显著优势，包括无二次污染和高降解效率，并已广泛应用于环境污染物的催化降解（Imamura等人，2021；Suresh等人，2023）。其中，硝基还原酶能够高效催化硝基化合物还原为羟胺或氨基衍生物，显示出在生物修复芳香族硝基污染物方面的巨大潜力（Boddu等人，2021）。在我们之前的研究中，发现来自南极海冰细菌Psychrobacter sp. ANT206的psntr基因编码了一种适应低温环境的硝基还原酶（PsNTR），该酶能够在低温下将芳香族硝基化合物转化为相应的氨基衍生物（Wang等人，2019）。然而，高酶纯化成本和酶活性不稳定是目前限制酶法去除污染物应用的主要问题（Ekeoma等人，2023）。因此，为了充分发挥这种适应低温环境的酶在废水处理中的应用潜力，迫切需要构建一个能够高效降解NB的生物催化系统。

通过利用多种高效表达系统，细胞表面展示技术实现了融合蛋白在外膜的稳定锚定（Nicchi等人，2021；Tian等人，2024）。此外，利用该技术的酶介导反应还具有低质量传递阻力和高底物可及性的优势（Tang等人，2014）。传统的游离酶容易失活且难以回收。此外，低温下膜流动性的降低限制了疏水性聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）底物的跨膜传递。相比之下，疏水性工程细胞表面展示（HCSD）系统结合了疏水蛋白，使得酶能够自发吸附在PET的疏水界面（Jia等人，2004）。这不仅增强了细胞与底物之间的亲和力，还在分子水平上实现了酶在底物表面的定向富集。此外，与细胞内表达相比，在大肠杆菌表面展示碳酸酐酶（CA）克服了外膜带来的质量传递限制，促进了HCO₃^-从细胞中的释放（Fan等人，2011）。然而，表面展示技术的应用常常受到异源蛋白大分子大小的制约，通常会导致宿主生长缓慢和膜完整性受损等问题。在这种情况下，基于冰核蛋白（INP）的锚定基序表现出显著优势：它促进了蛋白质的稳定表达并提高了转运效率，其长度可调的中心重复域（CRD）为不同大小的融合蛋白提供了灵活性，使其成为表面展示系统的优选策略（Khorsand等人，2024）。此外，该系统能够高效表达异源蛋白，同时有效维持宿主细胞的完整性和活力（Li等人，2012）。目前的研究证实，使用大肠杆菌和INPN锚定基序（假单胞菌 INP的N端片段）的细菌表面展示平台可以实现关键酶的功能表达，用于农药和抗生素的修复（Liu等人，2020）。值得注意的是，与C端功能域（INPC）相比，INPN不仅分子量更小，而且在表面展示应用中显著增强了酶活性，同时确保了融合蛋白的稳定表达和高效转运（Fan等人，2011）。因此，基于INPN的细胞表面展示技术实现了底物与酶活性中心之间的直接接触，从而显著消除了质量传递阻力，为污染物的高效酶降解提供了新的策略（Tian等人，2024）。

在实际的污染物降解应用中，游离的工程细菌面临反应条件苛刻、细胞易丢失以及重复使用困难等问题，这些因素共同导致了较高的处理成本（Mehrotra等人，2021）。相比之下，细胞固定技术可以有效解决这些问题。选择合适的固定载体对于实现高效稳定的生物降解过程至关重要（Najim等人，2024）。在各种载体材料中，硅藻土（DA）因其优异的综合性能而成为理想选择。作为一种主要由无定形二氧化硅（SiO₂组成的天然硅质矿物，它具有丰富的、相互连接的层次孔结构以及高比表面积，不仅为微生物细胞提供了充足的装载空间，还促进了底物和产物的高效质量传递。此外，DA具有稳定的化学性质和良好的机械强度，适合长期使用。此外，它广泛可用、成本低廉且环境友好（Zhang等人，2024；Záleská等人，2025）。为了克服传统DA吸附能力的局限性，研究人员对其进行了聚乙烯亚胺（PEI）等修饰。这一简单高效的过程通过提高固定细胞的效能，增强了生物修复中的污染物去除性能（Huang等人，2009）。研究表明，通过将整个细胞吸附到DA上，然后与PEI和GA共交联制备的固定大肠杆菌，可以用于催化（R, S）-扁桃酸（R-MA）的合成。基于此，固定系统赋予了游离细胞良好的操作稳定性和可重复使用性（Zhang等人，2016）。

本研究开发了一种结合细胞表面展示技术和固定细胞处理的系统，用于在低温下高效降解硝基苯。该系统利用INPN作为锚定载体，成功构建了展示PsNTR的工程菌株。多项实验确认了PsNTR在细胞膜上的定位，并系统评估了工程细菌的外膜完整性和生长特性。在此基础上，使用改性的DA（DA-PEI/GA）固定了工程菌株BL21/INPN-PsNTR，并对其长期稳定性、可重复使用性和NB降解性能进行了系统评估。本研究为开发适用于低温条件的高效NB生物降解技术奠定了基础。

菌株和材料

本研究中使用的菌株列于表1中。实验中使用的硝基苯（NB）、硅藻土（DA）和聚乙烯亚胺（PEI）由Aladdin（中国上海）提供。所有其他化学品均为分析级或更高级别，购自Sinopharm（中国北京）。

PsNTR的分子对接和定向突变

PsNTR的3D结构（GenBank访问号：MK503765）使用AlphaFold 3预测（https://golgi.sandbox.google.com），并通过结构分析和验证服务器进行了评估

表面展示菌株的构建及外膜完整性的评估

为了克服PsNTR的应用限制，包括其稳定性差和纯化成本高的问题，本研究利用细胞表面展示技术构建了工程菌株BL21/INPN-PsNTR，成功将目标蛋白定位在细胞表面。通过SDS-PAGE和Western blotting验证了融合蛋白INPN-PsNTR的定位（图1A-C）。诱导样本在全细胞中显示了特定的条带

结论

本研究采用了一种新的细胞表面展示系统，成功构建了工程菌株BL21/INPN-PsNTR。SDS-PAGE、Western blotting和蛋白酶可及性分析证实了INPN-PsNTR融合蛋白在大肠杆菌表面的稳定表达，工程菌株同时保持了正常生长和外膜完整性。为了提高工程菌株的储存稳定性和可重复使用性，研究人员使用了改性的硅藻土（DA）进行固定

CRediT作者贡献声明

王全福：撰写 – 审稿与编辑、监督、软件使用、资源管理、项目管理和资金获取、数据整理。邹一帆：可视化、实验研究。王亚彤：撰写 – 审稿与编辑、可视化、资源管理、实验研究、资金获取。侯艳华：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理和概念构思。李玉洁：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学研究、数据分析、概念构思

未引用的参考文献

García-Ríos等人，2014；Jia等人，2022；Metpally和Reddy，2009；Sen和Senol，2023；Wang等人，2025；Wang等人，2025；Wang等人，2022。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（中国，41876149）、山东省自然科学基金（ZR2023QD126和ZR2025MS552）、教学改革研究项目（2025ZZZC06）以及“双一流”学科建设基金（2023SYLHY08）的财政支持。