《Fish & Shellfish Immunology》：Characterization of Toll-like Receptor 22 in striped catfish (
Pangasianodon hypophthalmus): Recognition of Gram-Positive and Gram-Negative bacteria
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本研究成功表达鲮鲤TLR22四个截短的亚基，通过Dot blot和ELISA评估其对大肠杆菌、哈维氏菌等细菌的识别能力，发现LRR1-4亚基对革兰氏阳性菌和阴性菌均有最强结合力，抑制肽聚糖后结合信号下降，提示其通过肽聚糖识别机制，为研究鱼类先天免疫提供了新证据。
Thanh-Tan Nguyen | Hieu Tran-Van
越南胡志明市科技大学生物与生物技术学院生物传感器实验室
摘要
在Pangasianodon hypophthalmus中，Toll样受体22（TLR22）是鱼类先天免疫系统的关键组成部分，负责识别病原体相关分子模式（PAMPs）。然而，其识别细菌的机制在很大程度上尚未被探索，尤其是在条纹鲶鱼中。在这项研究中，四种TLR22重组亚基——TLR22(LRR1-17)、TLR22(LRR1-13)、TLR22(LRR1-10)和TLR22(LRR1-4)——已在Escherichia coli SHuffle? T7 Express中成功表达，通过SDS-PAGE和Western blot分析确认了蛋白质的表达。使用Dot blot和ELISA检测方法评估了这些亚基对Escherichia coli、Aeromonas hydrophila、Streptococcus agalactiae和Lactiplantibacillus plantarum的结合活性。在这些亚基中，TLR22(LRR1–4)表现出最强的结合亲和力，尤其是对革兰氏阳性细菌。此外，用小鼠血清预先阻断细菌肽聚糖显著降低了TLR22(LRR1–4)的结合能力，表明可能存在肽聚糖介导的相互作用。这些发现首次提供了实验证据，证明条纹鲶鱼的TLR22能够识别革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，从而扩展了对其配体识别谱的理解。这项研究强调了TLR22在细菌免疫检测中的潜在作用，并为进一步研究鱼类的先天免疫分子机制奠定了基础。
引言
条纹鲶鱼（Pangasianodon hypophthalmus）是越南湄公河三角洲养殖最广泛的鲶鱼品种之一，因其高营养价值和巨大的年经济贡献（Phan等人，2009年）。由于生长迅速且适应集约化养殖条件，它也是东南亚国家重要的淡水养殖物种（Dong等人，2015年；Jiang等人，2022年）。为了提高竞争力，持续改进生产效率和产品质量至关重要。然而，该行业面临的最大挑战是疾病爆发，因为鱼类容易受到多种病原微生物的感染。其中，黏液病、肝肾病和出血病在条纹鲶鱼中最为常见，通常由Aeromonas hydrophila和Edwardsiella ictaluri引起，死亡率通常在50%到90%之间（Gaunt等人，2015年；Nahar等人，2016年）。此外，多项研究表明，Streptococcus agalactiae作为致病菌之一，可能与食用受感染鱼类后的人类链球菌病爆发有关，突显了其人畜共患潜力（Kalimuddin等人，2017年）。目前，抗生素治疗仍被认为是这些细菌感染的有效方法。然而，鱼组织中的抗生素残留和抗菌素耐药性的出现已成为水产养殖和公共卫生的主要问题（Pham等人，2015年）。
在硬骨鱼类中，先天免疫系统是抵御病原体入侵的第一道防线（Mogensen，2009年）。其中，Toll样受体（TLRs）是位于免疫细胞表面或细胞质内的模式识别受体（PRRs），能够识别来自微生物的病原体相关分子模式（PAMPs）并激活下游免疫反应。已在鱼类中鉴定出20多种类型的TLRs（TLR1-4、5、7-9、13、14和18–26），其中TLR22是硬骨鱼类特有的，在哺乳动物中不存在（Palti，2011年；Quiniou等人，2013年）。它作为关键的PRRs之一，在感染过程中负责病原体检测和信号转导。结构上，TLR22是一种I型跨膜受体，由三个主要部分组成：细胞外外域（ECD）、跨膜区域（TM）和细胞内Toll/白细胞介素-1受体（TIR）域（Quiniou等人，2013年）。ECD包含多个亮氨酸富集重复（LRR）基序，使受体能够识别并结合来自病毒的双链RNA（dsRNA）和来自细菌的脂多糖（LPS）（Ding等人，2012年；Raetz & Whitfield，2002年；Samanta等人，2014年）。然而，配体识别的确切机制仍不清楚（Sundaram等人，2012年）。
本研究的目的是确定TLR22中主要负责识别细菌PAMPs的具体LRR区域。为此，使用Escherichia coli表达系统合成了含有LRR基序的TLR22外域截短亚基，并评估了它们与细菌的相互作用。这些发现为TLR22的细菌识别能力提供了新的见解，并阐明了体外实验条件下参与这一过程的功能域。
细菌菌株、培养基和培养条件
本研究中使用的细菌菌株列于表1中。E. coli菌株在Luria-Bertani肉汤（LB；HiMedia）中以250 rpm的速度摇床培养过夜。根据具体菌株调整培养温度：E. coli MC1061在37°C下培养，E. coli SHuffle? T7 Express在30°C下培养（Burns & Hull，1999年）。A. hydrophila在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB；HiMedia）中以30°C摇床培养过夜（Orozova等人，2012年），而S. agalactiae则在脑心
TLR22亚基的表达
质粒pET22b-tlr22(lrr1-17)、pET22b-tlr22(lrr1-13)、pET22b-tlr22(lrr1-10)和pET22b-tlr22(lrr1-4>分别转入Escherichia coli SHuffle? T7 Express细胞中，过夜培养后加入IPTG在30°C下诱导6小时以表达重组蛋白。通过SDS-PAGE分析并验证Western blot的结果表明，目标蛋白已成功表达。尽管没有检测到明显的过表达条带
讨论
本研究提供了新的证据，支持鱼类TLR22能够识别革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的潜力。先前的研究主要将TLR22描述为专门检测病毒双链RNA或来自革兰氏阴性细菌的脂多糖的模式识别受体（PRR）（Matsuo等人，2008年；Palti，2011年）。然而，我们的发现表明，条纹鲶鱼TLR22的重组亚基，特别是TLR22(LRR1-4)，表现出
结论
本研究成功在E. coli SHuffle? T7 Express中从P. hypophthalmus中表达了四种TLR22重组亚基。其中，TLR22(LRR1-4)对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的结合亲和力最高。抑制细菌肽聚糖后，结合信号减弱，证实TLR22可能通过肽聚糖相互作用识别革兰氏阳性细菌。这项研究首次提供了TLR22介导的
利益冲突
作者没有需要披露的利益冲突。
数据可用性
数据可在文章或其补充材料中找到。
作者贡献
Thanh-Tan Nguyen：概念构思、数据管理、正式分析、方法学、软件开发、验证、初稿撰写、审稿与编辑。Hieu Tran-Van：概念构思、资金获取、项目管理、监督、审稿与编辑。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。
致谢
本研究得到了越南安江省科学技术部的支持，项目编号为[373.2025.01。
