《Food Chemistry》：Protein fingerprinting using gold nanoparticle-assisted SPE and HPLC-UV: A promising tool for chemometric authentication of monofloral honeys
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本研究针对传统蜂蜜植物源鉴别方法（如花粉分析）耗时、主观性强的问题，开发了一种基于金纳米粒子辅助固相萃取（AuNP-assisted SPE）结合高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）的蛋白指纹图谱技术。研究人员通过对61份西班牙栗子、石南和百里香单花蜂蜜样本进行分析，成功鉴定出27种蜂源蛋白，并利用线性判别分析（LDA）模型实现了100%准确分类。该方法为蜂蜜真实性认证提供了一种快速、可靠的替代方案，具有重要的质量控制应用价值。
蜂蜜，这种由蜜蜂（Apis mellifera L.）精心酿造的天然甜味物质，自古以来就备受珍视，并受到如西班牙皇家法令68/2025等国际和国家标准的严格监管。它是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或渗出物，带回蜂巢后，经过蜜蜂口腔酶的加入以及蜂巢内的干燥和成熟过程转化而成。因此，蜂蜜是一种成分复杂的食品，含有来自植物和动物世界的营养物质和生物活性化合物。尽管碳水化合物是其主要成分，但它还含有多酚、蛋白质和酶、氨基酸、矿物质和维生素。
在蜂蜜市场中，单花蜂蜜因其独特的感官特性和被认为具有的保健功效而具有巨大的商业价值。然而，确定蜂蜜的植物来源并将其准确标识为单花蜂蜜存在主要难点。根据食品法典委员会的标准，一款蜂蜜要被称为单花蜂蜜，必须具有属于该特定来源的感官、物理化学和微观特性。目前，常用的方法是花粉分析（Melissopalynology），即通过显微镜识别蜂蜜中特定花粉粒的存在及其百分比来分类。但这种方法过程繁琐，需要熟练的人员手动识别花粉形态，已成为行业瓶颈，最终影响了单花蜂蜜的市场价格。
为此，研究人员不断探索更简单、成本更低的替代方法来分类单花蜂蜜。一些研究尝试利用蜂蜜的常规参数（如金属含量、水分、羟甲基糠醛、颜色和电导率等）结合主成分分析（PCA）或线性判别分析（LDA）等分类技术，但这些方法通常需要分析多个参数，且分类准确率往往低于90%。其他方法涉及分离技术，如气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析挥发性化合物，二维液相色谱-二极管阵列检测器（LCxLC-DAD）分析多酚指纹图谱，或超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）利用色谱指纹图谱。虽然这些方法通常能建立良好的分类模型，但它们依赖昂贵的仪器、分析时间长、数据收集劳动强度大，且需要专业人员操作，限制了其作为常规技术的应用。此外，电子舌或电子鼻等技术也显示出潜力，但其设备制备的复杂性阻碍了其在常规分析中的使用。
在蜂蜜的微量成分中，蛋白质作为植物源间接标记物的潜力尚未被充分探索。尽管一小部分蛋白质可能来自植物花粉，但绝大多数源自蜜蜂本身，主要是腺体分泌物、唾液酶以及在花蜜加工过程中引入的其他蜜蜂特异性蛋白质。有趣的是，这些蜂源蛋白的相对丰度和组成会随着花蜜或花粉的植物来源而变化。这是因为植物来源通过影响蜜蜂的蛋白质表达和分泌的多种因素（如花蜜和花粉的营养成分、氨基酸谱、与花蜜粘度和糖组成相关的酶诱导、甚至蜂蜜成熟过程中微生物活动的差异）间接发挥作用。因此，尽管蜂蜜蛋白主要来自蜜蜂，但其分布模式仍能反映植物来源，使其成为认证和分类的有价值的补充标记物。
在此背景下，发表于《Food Chemistry》的研究论文《Protein fingerprinting using gold nanoparticle-assisted SPE and HPLC-UV: A promising tool for chemometric authentication of monofloral honeys》提出了一种创新的解决方案。该研究由Paola Teresa Ogando-Rivas、Isabel Escriche、Ernesto Francisco Simó-Alfonso和Enrique Javier Carrasco-Correa共同完成，旨在开发一种利用金纳米粒子辅助固相萃取（SPE）结合高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）产生的可重现蛋白指纹图谱，来根据植物源对蜂蜜进行分类的方法。
关键技术方法概述
为开展研究，作者团队首先合成了表面修饰有金纳米粒子（AuNPs）的甲基丙烯酸酯基多孔有机聚合物（POP）材料作为固相萃取（SPE）吸附剂。研究人员收集了61份经感官、理化指标和花粉镜检确认为单一植物源的西班牙蜂蜜样本（包括栗子、石南和百里香）。样本经磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）溶解后，使用所制备的AuNPs-SPE小柱进行蛋白质的提取、净化和预浓缩。保留的蛋白质使用碱性PBS（pH 12）洗脱，中和后进行HPLC-UV分析。通过HPLC-MS/MS对色谱峰对应的蛋白质进行鉴定。最后，利用获得的蛋白质丰度数据，通过线性判别分析（LDA）建立分类模型，并使用训练集（40个样本）和独立验证集（21个样本）评估模型的分类性能。
研究结果
3.1. AuNPs-SPE吸附剂的制备、表征及其在蛋白质提取中的应用
研究人员成功制备并表征了金纳米粒子修饰的聚合物材料。扫描电子显微镜（SEM）证实了AuNPs在聚合物表面的成功附着，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定其金含量为0.032 wt%。该SPE系统的保留机制基于蛋白质在负载缓冲液pH接近其等电点（pI）时与AuNPs的强亲和力。选择pH 7.4上样，可最大化保留pI接近7.4的蛋白质，而pI显著偏离此值的蛋白质保留率会降低，从而实现选择性富集并去除基质干扰。该方法实现了2.5倍的蛋白质预浓缩，色谱图背景更干净。对不同植物源蜂蜜的SPE洗脱液色谱图比较显示，石南花蜂蜜的蛋白质峰数量最多，栗子蜂蜜次之，百里香蜂蜜最低。这表明不同蜂蜜的SPE蛋白指纹图谱存在差异。
通过HPLC-MS/MS鉴定，在所有SPE洗脱液中检测到的27种蛋白质均源自蜜蜂（Apis mellifera），未发现植物源蛋白质。这些蛋白质包括主要蜂王浆蛋白（MRJP3, MRJP4, MRJP5, MRJP7, MRJP6, MRJP9, MRJP1）、各种酶（如α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖氧化酶）、结构蛋白（如组蛋白H2A、微管蛋白α/β链、肌动蛋白相关蛋白8）、翻译延伸因子、热休克蛋白60A、防御素-1等。
对三种蜂蜜中25种蛋白质检测频率的分析揭示了显著的差异。例如，MRJP3、MRJP4和MRJP6在石南和栗子蜂蜜中100%检出，在百里香蜂蜜中检出率也较高。而β-淀粉酶在百里香蜂蜜中完全未检出，在栗子蜂蜜中检出率达83.3%，在石南蜂蜜中为39.1%。热休克蛋白60A、葡萄糖氧化酶和微管蛋白α链在百里香蜂蜜中检出频率最高（100%, 91.7%, 100%）。防御素-1在百里香蜂蜜中的检出频率（79.2%）也较高。这些差异反映了不同植物源蜂蜜中蛋白质分布的特征。
对SPE蛋白指纹图谱相对丰度（经内标归一化）的分析进一步揭示了植物源特异性模式。石南花蜂蜜的指纹图谱以MRJP3（13.87%）、MRJP5（15.29%）、MRJP7（23.14%）和组蛋白H2A（24.18%）为主，显示出较高的蛋白质多样性和以蜂王浆蛋白为特征的谱图。栗子蜂蜜则表现出更平衡的指纹图谱，翻译延伸因子2异构体X1（10.94%）、组蛋白H2A（9.66%）、防御素-1（4.40%）和MRJP9（4.19%）均有显著贡献。百里香蜂蜜的独特之处在于翻译延伸因子2异构体X1（18.73%）、组蛋白H2A（9.91%）、MRJP9（9.32%）、热休克蛋白60A（4.89%）和毒液丝氨酸蛋白酶34（6.77%）的丰度较高，显示出与应激反应和免疫防御相关的蛋白质富集趋势。
3.2. 分类方法
方差分析（ANOVA）及事后Tukey HSD检验表明，27种蛋白质中有23种在三种蜂蜜类型间存在高度显著性差异（p < 10-7），证实了蛋白指纹图谱差异的统计学意义。研究人员首先尝试使用701个蛋白质丰度比值变量构建LDA模型，虽然达到了100%的分类准确率，但模型需要27个比值变量，存在过参数化风险。随后，他们采用了基于蛋白质丰度总和归一化的方法构建LDA模型。该模型仅使用了11种蛋白质的归一化丰度作为变量，成功将蜂蜜样本清晰地分为三类。模型在训练集和独立验证集上均实现了100%的正确分类率。入选模型的蛋白质包括多种MRJPs、组蛋白H2A、翻译延伸因子2异构体X1、α-淀粉酶、GTP结合核蛋白、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶和微管蛋白α链。这些蛋白质的生物学功能（营养、发育、应激、免疫等）与不同植物源可能对蜜蜂生理状态产生的影响相吻合，为分类提供了生物学合理性。
结论与意义
本研究成功开发了一种基于AuNP-assisted SPE与HPLC-UV联用的蛋白指纹图谱新技术，用于单花蜂蜜的植物源认证和分类。该方法能够选择性富集蜂蜜中的蜂源蛋白质，生成重现性好的SPE蛋白指纹图谱，并有效降低基质干扰。研究证实，尽管所鉴定的蛋白质全部来源于蜜蜂，但其在SPE指纹图谱中的分布模式和相对丰度存在显著的植物源特异性差异。石南花蜂蜜显示出最丰富多样的蛋白质谱，以MRJPs和组蛋白H2A为主导；栗子蜂蜜的蛋白质分布更为均衡；而百里香蜂蜜则呈现出与应激和免疫防御相关蛋白质的独特富集特征。这些差异通过ANOVA得到了统计学的严格验证。
最重要的是，研究人员利用蛋白质丰度总和归一化数据建立的LDA分类模型，仅使用11个关键蛋白质变量，就在训练集和外部验证集上均实现了100%的准确分类。这证明了该方法的强大分类能力和可靠性。
该研究的重要意义在于：首先，它提供了一种快速、客观、可靠的替代方案，克服了传统花粉分析法的瓶颈问题，有望应用于蜂蜜质量的常规控制和市场监管。其次，该方法仪器设备相对常规，分析流程较快，具有实际应用的潜力。最后，该研究揭示了蜂源蛋白质的指纹图谱能够间接反映植物来源的影响，深化了对蜂蜜形成过程中生物化学复杂性的理解，为食品真实性认证领域提供了新的思路和技术路径。这种将选择性蛋白质提取与化学计量学分析相结合的策略，不仅适用于蜂蜜，也可能为其他食品的溯源和真实性鉴别提供借鉴。
