大曲微生物群中的储存驱动代谢转变调控白酒发酵过程中的风味形成

《Food Bioscience》：Storage-Driven Metabolic Shifts in Daqu Microbiota Regulate Flavor Formation during Baijiu Fermentation

本研究利用废弃茶树枝叶通过酶促氧化制备茶色素，优化反应条件（酶底物比0.6 U/mg，温度43℃，时间22 h），获得7.88%产率。分离纯化的茶黄素（TFs）、茶红素（TRs）、茶褐素（TBs）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）表现出显著抑制作用，MIC分别为156.25、312.5、1250 μg/mL，且作用机制包括细胞壁破坏、膜通透性改变及抑制生物膜形成，分子对接证实TFs与PBP2a结合有效抑制MRSA生长。茶色素作为天然抗菌剂在食品工业中前景广阔。

　　

Xueluan Liu|Xiaolin Feng|Chongxin Shi|Ying Wen|Xianchun Hu|Shuhong Lin|Yong Ye

华南理工大学化学与化学工程学院，广州，510640，中国

摘要

食品中的微生物污染可能导致食源性疾病，尤其是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA），由于其能够产生耐热性肠毒素并表达广谱抗生素耐药蛋白青霉素结合蛋白2a（PBP2a），对人类健康构成严重威胁。在本研究中，通过体外酶氧化法从废弃的茶树枝叶中制备出了具有强抗MRSA活性的茶色素。通过响应面法（RSM）获得了最佳工艺条件：酶底物比为0.6 U/mg，反应温度为43°C，反应时间为22小时，产率为7.88%。通过有机溶剂萃取和大孔树脂D101分离纯化的茶黄素（TFs）、茶红素（TRs）和茶褐素（TBs）表现出相似的酚类化合物光谱特性，平均分子量分别为208、368和16064 Da。TFs、TRs和TBs对MRSA的最小抑菌浓度（MIC）分别为156.25、312.5和1250 μg/mL，显示出比其对大肠杆菌更强的抗MRSA活性。此外，茶色素通过破坏细胞壁、改变细胞膜通透性、抑制生物膜形成、降低呼吸链脱氢酶活性以及增加细菌内的活性氧水平等机制发挥抗菌作用。分子对接实验表明，茶黄素能有效结合PBP2a，从而干扰MRSA的生长。作为抗MRSA的天然产物，茶色素在食品工业中具有广阔的应用前景。

引言

食品中的微生物污染是导致食品变质和腐败的主要原因。全球约有15-20%的食品因变质而被浪费，这对食品制造业构成了重大挑战（Snyder等人，2024年）。此外，食品中的微生物污染还会引发食源性疾病，严重影响人类健康（Roy等人，2024年）。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）是常见的引起食源性疾病的细菌病原体（Sun等人，2025年）。其中，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）不仅产生耐热性肠毒素，还会合成对β-内酰胺类抗生素具有低亲和力的青霉素结合蛋白2a（PBP2a），这使得MRSA能够发展出广谱耐药性，对人类健康构成严重威胁（Khan等人，2024年）。因此，迫切需要新的抗菌产品来应对日益严重的食品安全问题。天然抗菌防腐剂因其高生物安全性、广谱抗菌活性和低耐药性发展风险而受到广泛关注（Ma等人，2025年；Pinto等人，2023年）。 茶色素是植物来源的酚类色素，通过多酚氧化酶、过氧化物酶和其他内源性氧化酶对儿茶素多酚的作用在发酵茶中形成（Zhao等人，2023年）。它们是由多酚、糖类、氨基酸、黄酮类、生物碱和甾体等成分组成的复杂聚合物（Xu等人，2023年）。根据氧化和聚合程度，茶色素被分为茶黄素（TFs）（Wang等人，2024年）、茶红素（TRs）（Long等人，2023年；Zhu等人，2021年）和茶褐素（TBs）（Cheng等人，2024年）。茶黄素表现出剂量依赖性的抗菌活性，在高温和低pH环境下仍能保持良好的抗菌效果（Wang等人，2023年）。从茶多酚中制备的茶褐素（1 mg/mL）对金黄色葡萄球菌的抑制率为51.45%，对大肠杆菌DH5α的抑制率为45.05%（Chen等人，2024年）。不同类型和比例的儿茶素制备的茶褐素对大肠杆菌的抑制效果存在显著差异（Chen等人，2023年）。然而，不同氧化和聚合程度的茶色素之间的抗菌活性差异尚不明确，需要进一步研究以阐明其抗菌机制。 目前，茶色素的主要来源是从发酵茶中提取或通过体外氧化茶多酚制备。低温水萃取结合大孔树脂分离技术从普洱茶中分离出了平均分子量超过10,000 Da的五种茶褐素（Zhang等人，2024年）。从康藏黑茶中提取的茶褐素表现出优异的体外抗氧化性能（Liu等人，2022年）。使用茶多酚作为底物和马铃薯多酚氧化酶进行合成，在最佳条件下茶黄素的产率为651.75 μg/mL（Li等人，2022年）。多酚氧化酶的类型以及儿茶素的类型和比例会影响茶黄素的产量（Hua等人，2021年）。从茶多酚化学氧化得到的茶褐素显著抑制了人类肺癌细胞的生长（Wang等人，2022年）。无论是通过弱碱性氧化还是酶辅助化学氧化制备的茶褐素，都对结肠癌细胞表现出优异的抑制效果（Chen等人，2022年；Yuan等人，2022年）。然而，这些茶色素的生产途径通常成本较高、产量较低且工艺复杂，限制了其工业应用。 考虑到未来的工业化需求，本研究使用价格低廉的漆酶通过酶氧化法从废弃的茶树枝叶中制备了茶色素，并通过响应面法（RSM）优化了工艺条件。通过有机溶剂萃取和大孔树脂分离纯化，获得了茶黄素（TFs）、茶红素（TRs）和茶褐素（TBs）。研究了这些茶色素对MRSA和大肠杆菌的抑制活性，并以MRSA作为指示菌株探讨了其抗菌机制。本研究提供了茶色素的制备方法及其在食品工业中作为抗菌防腐剂的潜在应用。

材料

从中国广东省清远市英德市收集了9月至11月秋季修剪后废弃的茶树枝叶。漆酶（10,000 U/g）购自合肥千盛生物科技有限公司。使用的大孔吸附树脂D101（BR）、花色素试剂、考马斯亮蓝、氨苄西林钠（生物技术级）、2-硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，99%）、0.1%结晶紫、碘硝基四唑紫（INT，98%）、10%三氯乙酸等。

单因素实验分析

反应时间对茶色素产量的影响主要体现在TFs和TRs的含量上，随着反应时间的延长，其含量先增加后减少（图1A和B），而TBs则呈现持续增加的趋势（图1C）。在较长的反应时间内，TFs和TRs进一步氧化聚合形成TBs（Lee等人，2015年）。最终，总茶色素的产量呈现出先增加后减少的趋势，在20小时时达到峰值（图1D）。

结论

通过漆酶的体外氧化从废弃的茶树枝叶中制备了茶色素。通过响应面法优化了制备工艺，得到最佳条件：酶-底物比为0.6 U/mg，反应温度为43°C，反应时间为22小时。在这些条件下，茶色素的产量为7.88%。通过进一步分离纯化获得了三种茶色素：茶黄素（TFs）、茶红素（TRs）和茶褐素（TBs）。

CRediT作者贡献声明

Xueluan Liu：撰写——原始稿件，概念构思。 Yong Ye：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。 Shuhong Lin：数据分析。 Ying Wen：数据可视化，验证。 Xianchun Hu：数据分析。 Xiaolin Feng：软件操作，方法学设计。 Chongxin Shi：资源协调，实验设计。

未引用参考文献

Chen等人，2024年；Ma等人，2025年；Wang等人，2023年。

利益声明

作者声明没有利益冲突。

竞争利益声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢广州市科技计划项目（编号2024B03J1269）、清远市科技计划项目（编号2022DZX009）以及大学生创新创业培训项目（编号s202510561235）提供的财政支持。