《Food Research International》：Computational design of a highly active and stable alkaline pectate lyase: Unraveling the molecular mechanisms for superior performance
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基于分子动力学模拟与自由能优化的果胶 lyase 理性设计策略，成功开发出 S184A/D262E 双突变体，其催化效率提升8.19倍，热稳定性达80.9℃熔点，半衰期延长至61.74分钟（70℃, pH10），并在生物退浆中实现湿接触面积1.28倍提升。
赵梅|李浩阳|陈娇娇|张晓浩|潘晓红|孙雷|郭亮|齐向辉
江苏大学食品与生物工程学院，中国江苏省镇江市学府路301号，212013
摘要
果胶裂解酶对于利用富含果胶的生物质至关重要。然而，由于在恶劣操作条件下的稳定性和效率较低，其工业应用受到限制。为了克服这些挑战，我们采用了一种多方面的计算设计策略，结合了多温度（310.15 K、343.15 K和363.15 K）下的分子动力学模拟，以识别远端柔性区域。同时利用FireProt、PROSS和HotSpot等工具对近端活性位点进行自由能引导的优化，从而协同提升酶的性质。从46个单点突变体的初步筛选中，表现最佳的变异体D262E与S184A结合，得到了双突变体S184A/D262E。该变异体在催化效率上表现出显著提升，催化效率提高了8.19倍（k_cat/Km），熔点为80.90°C，在70°C和pH 10.0条件下半衰期为61.74分钟。观察到的稳定性提升归因于疏水堆积的增强、优化的氢键网络以及溶剂可及性的降低，这些因素共同使其在极端条件下表现出良好的性能。当应用于织物生物洗涤时，S184A/D262E变异体显著提高了亲水性，润湿面积增加了1.28倍。这一表现证明了该变异体在工业应用中的优越性。本研究展示了一种可推广的方法，能够同时改善酶的活性和稳定性，非常适合在苛刻的工业条件下高效提纯生物质。
引言
农业废弃物，特别是水果加工副产品（如柑橘和苹果渣）是果胶的重要来源。然而，令人担忧的是，只有约20%的这些副产品被用于动物饲料，导致其营养和经济潜力未得到充分利用（Babbar等人，2016年）。其余的有机废弃物被填埋处理，加剧了资源利用不足，并对环境产生了负面影响（Boukroufa等人，2015年）。因此，开发高效的农业废弃物回收方法对于促进可持续实践至关重要（Aziz等人，2025年；Wang等人，2024年；Wu等人，2025年）。
在农业废弃物生物质脱胶过程中，包括纤维素酶、木聚糖酶和果胶裂解酶（PEL，EC 4.2.2.2）在内的多种工业酶被广泛使用（Zhao等人，2025年）。其中，PEL酶在通过β-消除作用催化果胶酸和果胶中的α-1,4-糖苷键断裂，生成不饱和的低聚半乳醛酸酯方面起着关键作用（Zhao等人，2025年；Zhao，2022年）。值得注意的是，耐热和耐碱的PEL酶具有巨大的应用潜力和市场前景，特别是在苛刻的工业过程中，如碱性生物质处理（Rukhma等人，2024年）。然而，要提高它们的耐热性和催化效率以满足工业需求仍面临重大挑战（Zhang等人，2024年）。
为了解决这些挑战，已经开发了多种策略，包括定向进化和理性设计（Xu等人，2025年）。与定向进化相比，特别是通过计算方法进行的理性设计通常更高效、耗时更少且所需劳动力更少，往往能以较少的筛选工作量实现所需的改进（Braun等人，2026年；Kim等人，2026年；Koenekoop & ?qvist，2023年；Tian等人，2025年；Ullah等人，2025年；Wang等人，2025年；Zhang等人，2024年）。例如，Seyedarabi等人通过对BsPel的结构分析，识别出关键的底物结合残基，R279A变异体对高度甲基化的果胶的催化效率提高了两倍（Seyedarabi等人，2010年）。Chen等人通过蛋白质截短工程，获得了PEL突变体PelD-II，其活性提高了3.1倍（从51.0 U mg^-1提高到160 U mg^-1）（Chen等人，2025年）。同样，Zhou等人稳定了PEL中的高度保守的α-螺旋结构，得到了最优突变体K93I/G241A，其活性提高了1.3倍（从1602 U mg^-1提高到2707 U mg^-1），半衰期在60°C下延长了15.9分钟（从33.47分钟提高到49.33分钟），熔点提高了1.6°C（Zhou & Wang，2021年）。Li等人通过环替换获得了PEL突变体BspPel-th，其活性提高了4.4倍（从...提高到31.6 U mg^-1）（Li等人，2023年）。Wang等人采用基于结构的设计，得到了PEL突变体K47D/V132F/R272W，其比活性提高了4.4倍（从353 U mg^-1提高到1544 U mg^-1），T50值提高了2.5倍（从2.2小时提高到5.6小时）（Wang等人，2018年）。为了进一步提高效率和耐热性，越来越多地协同应用远端策略（针对远离活性位点的区域）和内部策略（针对活性位点或近端区域）（Luo等人，2025年）。
远端策略通常利用基于分子动力学模拟（MDS）的计算方法（Gu等人，2023年；Gu等人，2024年；Huwaimel等人，2025年）。例如，Wang等人开发了一种综合的C-S-E（计算MDS设计、结构分析和实验验证）策略，选择了M12（A7C/P210H/W277P/G304C）变异体，其活性提高了2.1倍，热稳定性提高了7.6倍（Wang等人，2025年）。同样，Yuvaraj等人利用MDS引导对柔性区域进行理性设计，得到了具有优异热稳定性的L-阿拉伯糖异构酶突变体（Ravikumar等人，2025年）。相比之下，内部策略通常基于物理模型计算方法，依赖于Gibbs自由能（ΔΔG）计算（Baumer & Whitehead，2021年）。值得注意的是，像PROSS和FireProt这样的基于物理模型的策略在提高酶的耐热性方面显示出显著潜力（Chen等人，2022年）。例如，Niu等人使用PROSS生成了最稳定和最活跃的突变体M7–8，其半衰期提高了77倍（Niu等人，2025年）。Chen等人使用FireProt设计了PgUGT突变体，筛选出的Mut8活性提高了3.2倍，最佳反应温度提高了5°C（Chen等人，2022年）。尽管取得了这些进展，但将远端和内部计算策略协同结合以同时提高PEL的耐热性和催化效率的研究仍不充分（Tang等人，2025年）。
先前表征的来自Shouchella clausii S10的碱性PEL（PelA）在苎麻脱胶结合化学处理时表现出优异的性能（70°C，pH 10.5，936.2 U mg^-1）（Zhou等人，2017b）。然而，PelA在其最佳温度70°C下稳定性较差，导致工艺效率大幅降低，成为其工业应用的主要障碍。因此，为了提高其耐热性和催化效率，本研究采用了一种多方面的计算设计策略，结合了多温度（310.15 K、343.15 K和363.15 K）下的分子动力学模拟来识别远端柔性区域，并与自由能引导的近端活性位点协同优化相结合。这种方法系统地构建了Shouchella clausii来源的PEL（PelA）的单点突变体库，包含46个变异体。通过严格的实验筛选标准，确定了五个最佳的单点突变体，通过迭代组合突变得到了表现最佳的双突变体S184A/D262E。随后的结构表征和分子动力学模拟揭示了其耐热性和催化效率提升的分子机制。通过在可持续纺织生物洗涤应用中的系统评估，证明了其实际效用。总体而言，这些发现为果胶酶耐热性的理性设计提供了关键的机制洞察，并为未来工业相关生物催化剂的设计和优化建立了有价值的计算框架。
化学品和试剂
聚半乳醛酸（PGA，纯度≥90%，产品编号81325）作为酶活性测定的底物，购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。限制性内切酶、PCR相关试剂、质粒提取试剂盒和One-Step克隆试剂盒来自Vazyme Biotech有限公司（中国南京）。除非另有说明，所有其他化学品和溶剂均为分析级，购自Sangon Biotech（中国上海）。
菌株和质粒
使用了大肠杆菌 DH5α
用于工程化高性能PelA突变体库的多方面计算设计策略
在酶工程中，理性设计通常关注两个互补的方向（Huang等人，2025年）：1）远端位点修饰（例如，修改活性中心10 ?以外的二级结构、表面环区域和疏水核心），通过构象优化间接提高催化效率、特异性和稳定性（尽管受到不完整结构网络的限制）；2）近端位点修饰，如活性口袋邻近区域的突变。
结论
为了提高Shouchella clausii S10来源的PEL PelA在碱性条件下的热稳定性和催化效率，本研究采用了一种多方面的计算设计策略。通过多温度分子动力学模拟（310.15 K、343.15 K和363.15 K）识别远端柔性区域，同时应用了互补的计算机辅助设计策略（FireProt、PROSS和HotSpot）来针对近端柔性区域，从而确定了46个...
CRediT作者贡献声明
赵梅：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，监督，研究，资金获取，正式分析，概念化。李浩阳：撰写 – 原始草稿，研究，正式分析，数据管理。陈娇娇：撰写 – 原始草稿，研究，正式分析，数据管理。张晓浩：撰写 – 审稿与编辑，可视化。潘晓红：撰写 – 审稿与编辑，可视化。孙雷：撰写 – 审稿与编辑。郭亮：撰写 –
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFC2105502）、国家自然科学基金（32200061、22208124）、江苏省自然科学基金（BK20210752）和国家博士后科学基金（2022 M721390、2023 T160278）的支持。
