底物可用性与柠檬酸通过调控TCA循环代谢和SLC13A3影响巨噬细胞免疫应答

《Immunology Letters》：Substrate availability and citrate alter TCA cycle metabolism and SLC13A3 in macrophage immune responses

本研究针对标准细胞培养基（如DMEM）营养成分与生理血浆存在差异、可能影响免疫细胞代谢与功能的问题，开展了关于底物可用性如何调控巨噬细胞免疫代谢的研究。研究人员通过构建生理相关性培养基（mDMEM），结合稳定同位素示踪（如13C）与质谱技术，发现柠檬酸（citrate）是连接胞外底物可用性与胞内代谢的关键介质，能调节IL-6分泌和质膜转运体NaDC3（SLC13A3）的表达。该研究揭示了生理性营养环境对免疫代谢通路的重要影响，为靶向免疫代谢的干预策略提供了新见解。

　　

在免疫学研究领域，细胞培养是探索细胞功能的基础。然而，自20世纪50年代发展起来的传统细胞培养基，如广泛使用的DMEM（Dulbecco‘s Modified Eagle’s Medium），其设计初衷是最大化支持细胞增殖和存活，导致其营养成分构成与人体血浆的实际成分存在显著差异。许多在血浆中存在并具有重要生物学功能的代谢物，如丙氨酸（Ala）、天冬酰胺、柠檬酸（citrate）、乳酸（Lac）、丙酮酸和β-羟基丁酸（βHB）等，在标准DMEM中却完全缺失。这种“非生理性”的培养环境是否会影响免疫细胞的代谢及其功能，特别是像巨噬细胞这类在免疫应答中扮演关键角色的细胞，其代谢重编程（metabolic reprogramming）如何受外界营养环境影响，其中的机制尚不完全清楚。巨噬细胞能够敏锐感知微环境信号，而线粒体及其三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle, TCA循环）中间产物作为信号分子，在调控免疫反应中起着核心作用。其中，由免疫应答基因1（Irg1）编码的蛋白IRG1/ACOD1催化产生的衣康酸（itaconate），已成为一个关键的免疫调节效应分子。因此，在更接近生理状态的营养条件下研究巨噬细胞的免疫代谢，对于准确理解其在健康和疾病中的功能至关重要。

为了回答上述问题，研究人员开展了一项系统性的研究，相关成果发表在《Immunology Letters》上。本研究主要应用了几项关键技术方法：首先，研究人员设计并使用了改良的DMEM培养基（mDMEM），其成分（如降低葡萄糖和谷氨酰胺浓度，并补充多种生理性碳源）更接近小鼠血浆水平。其次，他们利用稳定同位素标记的代谢物（如[U-13C₆]葡萄糖、[U-13C₅]谷氨酰胺和[2,4-13C₂]柠檬酸）进行代谢流分析。第三，采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对细胞内代谢物进行定性和定量分析，包括测定代谢物丰度和同位素标记分布。第四，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子白细胞介素-6（IL-6）的分泌水平。第五，使用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测相关基因（如Irg1, Slc13a3）的表达变化。第六，利用Seahorse能量分析仪测量细胞的耗氧率以评估线粒体呼吸功能。研究所用的细胞模型为小鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7。

3.1. 替代碳源影响巨噬细胞的免疫代谢

研究人员首先在标准DMEM中单独补充生理浓度的丙氨酸（Ala）、β-羟基丁酸（βHB）或乳酸（Lac），观察它们对巨噬细胞的影响。结果发现，这些替代碳源的添加并未显著改变LPS（脂多糖）诱导的IL-6分泌和Irg1基因的表达，但略微提高了衣康酸的水平。同时，LPS刺激普遍下调了质膜转运体Slc13a3基因的表达。通过稳定同位素示踪技术，他们发现当存在这些替代碳源时，源自13C标记的葡萄糖和谷氨酰胺的碳原子向TCA循环中间产物及衣康酸的掺入减少，这表明细胞降低了对葡萄糖和谷氨酰胺的依赖，转而利用外源性替代碳源进行代谢，展现了巨噬细胞的代谢灵活性。

3.2. 含有替代碳源可用性的改良培养基改变巨噬细胞的免疫应答

为了更全面地模拟生理环境，研究人员创建了改良培养基mDMEM，其特点是降低了葡萄糖和谷氨酰胺的浓度，并同时补充了多种生理性碳源。与标准DMEM相比，在mDMEM中培养的巨噬细胞，在LPS刺激后表现出更高的IL-6分泌和Irg1基因表达，但衣康酸水平却降低了。更重要的是，在未受刺激的条件下，mDMEM中的巨噬细胞其Slc13a3基因的表达水平显著高于标准DMEM中的细胞。这些结果表明，培养基成分的全面改变能显著影响巨噬细胞的免疫反应和代谢状态。

3.3. 生理性碳源在mDMEM中诱导代谢重编程

通过代谢组学分析，研究人员发现，与标准DMEM相比，在mDMEM中培养的巨噬细胞其TCA循环中间产物（如α-酮戊二酸, αKG和苹果酸）的细胞内丰度降低。稳定同位素示踪实验进一步证实，在mDMEM中，无论是来自葡萄糖还是谷氨酰胺的碳原子，向TCA循环中间产物和衣康酸的掺入均显著减少。这清晰地表明，在生理相关性更强的营养条件下，巨噬细胞更多地利用了培养基中补充的替代碳源，从而减少了对经典碳源（葡萄糖和谷氨酰胺）的利用。

3.4. 柠檬酸在含有替代碳源的培养基中影响免疫应答

鉴于柠檬酸是mDMEM中补充的关键代谢物之一，且上述实验观察到Slc13a3表达的变化（该转运体可运输柠檬酸），研究人员深入探究了柠檬酸的具体作用。他们发现，在mDMEM中补充柠檬酸会导致细胞内柠檬酸的13C标记比例下降（同位素稀释效应），但不影响其他TCA循环中间产物或衣康酸的标记，提示外源性柠檬酸并未被大量氧化供能。有趣的是，柠檬酸的添加增强了mDMEM中巨噬细胞的线粒体基础耗氧率。功能上，柠檬酸的存在是导致mDMEM中IL-6分泌升高和衣康酸水平降低的关键因素；当从mDMEM中去除柠檬酸后，IL-6分泌和衣康酸水平均恢复至接近标准DMEM的状态。同时，柠檬酸也负责驱动了mDMEM中观察到的Slc13a3基因表达的上调。

研究结论与讨论部分强调，本研究揭示了在生理相关性培养基中，巨噬细胞能够灵活地利用多种碳源来维持其代谢和功能。特别重要的是，柠檬酸被识别为一种关键的胞外信号分子，而不仅仅是代谢燃料，它能够调节巨噬细胞的炎症反应（如IL-6分泌）、免疫代谢物（如衣康酸）的积累以及特定转运体（SLC13A3）的表达。这项研究的意义在于，它强调了体外培养系统的营养环境对免疫细胞研究结果的深刻影响。标准培养基与生理血浆的营养差异可能导致对免疫细胞代谢和功能的不准确解读。因此，在未来的免疫代谢研究中，采用生理相关性的培养条件至关重要。该发现不仅深化了对巨噬细胞免疫代谢调控的理解，也为开发针对代谢性疾病或炎症性疾病的新治疗策略（例如，通过调节特定代谢物如柠檬酸的水平）提供了新的思路和潜在靶点。研究还指出，柠檬酸与SLC13A3 transporter的相互作用以及其在衣康酸代谢动态调节中的作用，是值得进一步探索的方向。