aggC基因的破坏增强了Shewanella oneidensis对多种污染物的还原转化能力

《International Biodeterioration & Biodegradation》：Disruption of the aggC gene enhances Shewanella oneidensis reductive transformation of a wide range of contaminants

微生物通过外源电子传递（EET）还原环境污染物的研究发现，Shewanella oneidensis的aggC基因中断突变体MO1在甲基橙（MO）等电子受体还原中表现出更快的脱色速度和生长速率，机制与细胞内c-di-GMP水平降低及ATP消耗减少相关，为生物修复提供了新策略。

　　

李伟东|Rachel Obeng|张勇|罗鹏

中国重庆市西南大学资源与环境学院，邮编400716

摘要

能够进行细胞外电子转移（EET）的微生物可以通过还原反应来降解氧化性污染物。人们已经探索使用基因工程来增强这些过程，特别是通过修改EET途径。本研究探讨了加速氧化性污染物还原的意外生物学机制。我们构建了一个含有Shewanella oneidensis转座子插入突变体的文库，并以甲基橙（MO）作为唯一的电子受体（EA）进行培养。经过多次转座后，MO的还原速率加快，其中在aggC基因上发生插入的突变体变得占主导地位。该基因在生物膜形成中起重要作用，但在可溶性EA的还原过程中并非必需。一个代表性的突变体MO1比野生型（WT）和互补菌株（MO1-4318C）更快地使MO脱色并且生长更快。然而，当细胞密度标准化后，MO的还原速率相当，这表明MO1更快的脱色是由于生长速度加快而非内在还原活性的增强。我们提出，aggC基因的破坏降低了细胞内环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）的水平，从而减少了与生物膜形成相关的生物合成过程，使更多的细胞资源用于增殖。在MO支持的生长过程中，MO1细胞内的ATP水平较高，进一步支持了这一假设。当使用其他支持Shewanella生长的电子受体（如苋菜、蒽醌-2,6-二磺酸盐、柠檬酸铁）进行测试时，也观察到了类似的生长速率、ATP含量和电子受体还原速率的趋势，其中MO1的表现优于其他菌株。当污染物作为电子受体但无法支持生长时（例如萘酚绿B、六价铬），MO1的存活时间比WT和MO1-4318C更长，这可能是由于aggC基因破坏导致ATP消耗减少，从而加快了污染物的生物转化。

引言

某些微生物能够克服细胞包膜屏障，通过细胞外电子转移（EET）与外部电子供体或受体交换电子（Zhang等人，2024a）。EET在多种自然过程中起着重要作用（Zhao等人，2025），包括氧化还原活性金属的生物地球化学循环、腐殖物质的氧化还原转化、甲烷生成和甲烷氧化。在工程化环境中，微生物对固体电极的EET是开发微生物电化学系统的基础，这些系统能够实现化学能与电能的相互转换（Ter Heijne和Harnisch，2024）。据报道，EET还有助于降解各种氧化性环境污染物（Xie等人，2021），从环境保护的角度来看，这一过程通常是可取的。例如，某些重金属的还原可以降低其毒性（Yang等人，2025）。同样，染料中偶氮键的还原是它们后续生物降解的前提（Hong等人，2007），而硝基芳烃转化为芳香胺可以降低毒性并提高生物降解性（Wang等人，2024）。此外，像铀、锝、镎和钚这样的放射性元素在氧化状态下是可溶的，但在还原后会因溶解度降低而变得不溶。尽管非EET能力的微生物也能降解氧化性污染物，但EET能力的微生物通常更有效。它们可以降解多种环境污染物，并且在许多情况下可以利用这些污染物作为电子受体（EA）。这种能力减少了生物修复过程中持续补充微生物的需求。

已经采用多种策略来增强EET能力微生物对污染物的还原生物转化。这些策略包括使用电子穿梭蛋白来加速还原速率（Zhang等人，2024b）以及形成微生物-导电纳米材料复合材料以增加可用的反应位点（Chen等人，2024；Yan等人，2014）。此外，还应用基因工程来提高微生物的性能。例如，Yang等人（2022）在Shewanella carassii-D5中异源表达了负责核黄素生物合成的合成基因簇（ribADEHC），增强了其降解甲基橙（MO）的能力。Li等人（2021）评估了三种改造Shewanella oneidensis的策略：（1）在强启动子下过表达mtrCAB和ribD-ribC-ribBA-ribE基因簇，以增强直接和间接的EET；（2）引入编码腺苷酸环化酶的外源基因，以提高细胞内cAMP水平，从而增强电子生成；（3）抑制竞争性的电子转移（ET）途径，以优化通过Mtr通道的电子流动，这在减少目标污染物方面起着关键作用（Belchik等人，2011；Cai等人，2012）。与野生型菌株（WT）相比，这些工程菌株对MO和六价铬（Cr(VI)的还原速率显著提高。此外，作者开发了一种基于群体感应的种群状态决策系统，动态分配细胞资源用于细菌生长和EET增强，进一步提高了污染物的还原效率（Li等人，2020，2021）。尽管取得了这些进展，但仅专注于优化EET的策略仍受到对微生物还原不同电子受体分子机制及其复杂调控网络理解不足的限制（Liang等人，2023）。此外，由于不同的氧化性污染物通常通过不同的途径被还原（Wang等人，2020；Zhu等人，2022），为某一目标设计的EET系统可能并不具有广泛的适用性。Liang等人（2023）提出了一种独立于EET途径的方法，通过合成生物工程增强Shewanella的ATP利用。这一策略刺激了整体代谢活性，提高了MO和Cr(VI)的还原速率，表明微生物生化活动中之前被忽视的方面——不仅仅是EET本身——可能在污染物生物转化中起着重要作用。

转座子在基因组内的移动能力使得基因功能能够稳定且可遗传地发生破坏，从而便于生成大规模的突变体文库。这种破坏可能会影响在特定环境条件下表现最佳的基因，从而实现功能基因组筛选。这种策略已被用于识别对偶氮染料脱色重要的Shewanella基因，其中在96孔板中系统评估了40,000个随机转座子插入（Tn）突变体（Brige等人，2008）。在某些情况下，基因破坏可以带来有益的性状；例如，在缺乏某些细胞色素或PilZ结构域蛋白基因的Geobacter和Shewanella突变体中观察到了电力生成的提高（Bretschger等人，2007；Leang等人，2013；Otero等人，2021）。当Tn文库中存在这种有益的破坏时，相应的突变体在选择性条件下培养时往往会胜过其他突变体，从而得到富集。例如，Kouzuma等人（2010）使用含有转座子的质粒构建了一个Shewanella Tn突变体文库。在电化学细胞中培养600小时后，他们分离出一个在SO3177基因上发生破坏的菌株，该基因参与多糖合成。这个突变体表现出更强的生物膜形成能力和更高的电力生成。

利用模型EET生物S. oneidensis，我们证明了Tn诱变可以用于增强环境污染物的生物转化。MO是一种模型偶氮染料（Liang等人，2023），并且已被证明当作为唯一的EA时可以支持Shewanella的生长（Cai等人，2012）。因此，我们富集了能够在含有MO的20毫升厌氧瓶中更快降解MO并生长的突变体，然后评估这些富集的突变体是否也能比WT更快地降解其他电子受体。与WT相比，分离出的突变体在各类污染物（包括偶氮染料、三芳基甲烷染料、重金属和硝基芳烃）上的还原速率更快。有趣的是，发生破坏的基因与ET系统无关。基于这一观察，我们发现了另一种加速污染物转化的机制。

部分内容片段

Tn突变体文库的构建

使用转座子质粒pTnMod-OKm（Dennis和Zylstra，1998）通过电穿孔技术生成了S. oneidensis MR-1的Tn突变体。为了制备电感受态细胞，收集处于早期指数期的MR-1培养物，用冰冻蒸馏水洗涤两次，然后重新悬浮在含有1 mM 3-(N-morpholino)propanesulfonic酸的15%（v/v）甘油溶液中。将200 μL的电感受态细胞转移到1毫米间隙的电穿孔比色皿中并进行处理

Tn突变体的富集

在第一个富集周期中，与Tn突变体文库共培养54小时后，厌氧瓶中仍可见残留的MO（图1）。尽管第二个富集周期的初始细胞浓度相同，但脱色过程明显加快（图1）。与第一个周期相比，第二个周期结束时厌氧瓶中剩余的MO百分比显著降低（P < 0.05），从5.98 ± 0.87降至4.15 ± 0.46。到第三个周期时，这一情况

结论

通过选择在含有MO的培养基中的S. oneidensis Tn突变体，我们富集了aggC基因被破坏的MO1菌株，证明了通过不同的微生物ET机制加速了多种可溶性电子受体的还原。aggC基因的破坏可能消除了不必要的ATP消耗，增强了细胞生长或存活能力，从而加快了电子受体的还原。这一机制与常见的针对电子传输途径的方法不同。未来的工作可以探索附加策略

CRediT作者贡献声明

李伟东：数据可视化、实验研究。Rachel Obeng：实验研究。张勇：撰写——审稿与编辑、监督、方法学。罗鹏：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢华盛顿州立大学化学工程与生物工程学院的曹斌教授和中国地质大学环境研究学院的胡一丹教授提供的pHYD-R2质粒。

本研究得到了重庆海外归国人员创业与创新支持计划的支持。