用于体外建模马结节瘤的工程化生物聚合物水凝胶在比较肿瘤学中的应用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Engineered biopolymeric hydrogels for in vitro modeling of equine sarcoid tumors in comparative oncology

胰岛素在pH2、60℃和搅拌条件下的纤维化动力学研究显示，C6和C4表面活性剂在特定摩尔比下抑制纤维化，而C2表面活性剂在摩尔比7时促进纤维化，纤维富含β结构。

　　

Pouneh Sadat Pourhosseini|Sara Fayazzadeh|Ali Akbar Saboury|Farhood Najafi|Mina Evini

生物技术系，生物科学学院，阿尔扎赫拉大学，1993893973，德黑兰，伊朗

摘要

在本研究中，牛胰岛素在pH值为2、温度为60°C且伴有搅拌的条件下被纤维化67小时，并对其纤维化动力学进行了详细研究。随后，在相同条件下，考察了三种阳离子脲烷型 Gemini 表面活性剂（其间隔基团中的亚甲基单元数分别为C₂、C₄和C₆）对蛋白质纤维化的作用。在没有表面活性剂的情况下，纤维化动力学呈现S形曲线，证实了纤维的形成，这一结果得到了透射电子显微镜（TEM）的支持。在C₆和C₄表面活性剂存在的情况下，当 Gemini 与蛋白质的摩尔比为C₆:X=5和C₄:X=3时，未观察到S形曲线，表明这些表面活性剂抑制了纤维化过程。然而，在C₂表面活性剂的情况下，当摩尔比为X=7时，观察到了典型的S形曲线，TEM结果也显示存在明显的纤维结构。C₂表面活性剂在提到的摩尔比下加速了纤维化动力学，并对纤维化过程具有促进作用。此外，无论是否存在 Gemini 表面活性剂，在纤维化过程结束时（67小时后），胰岛素的二级结构都以β-折叠结构为主。总体而言，C₆和C₄表面活性剂抑制胰岛素纤维化的机制可能是通过阻止部分展开的单体之间的相互作用。

引言

蛋白质聚集是一种在医学领域具有广泛影响的现象，蛋白质聚集体在体内会引起严重的不良后果[1]。通常，蛋白质聚集体分为两类：具有高度有序结构的淀粉样纤维和无定形聚集体[1]、[2]、[3]。淀粉样纤维具有分支较少的纤维形态，直径约为10纳米，长度可达几微米[1]、[3]、[4]、[5]、[6]。这些结构表现出多种独特的物理化学性质[1]、[7]、[8]、[9]、[10]；其中最重要的是它们具有特征性的β-折叠结构[2]、[5]、[6]、[7]、[8]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。淀粉样纤维在组织和器官中的沉积与25多种被称为“淀粉样变性”的退行性疾病有关[8]、[13]、[17]、[18]、[19]。有关不同类型淀粉样疾病的全面概述及其描述，可参考相关文献[8]、[9]、[12]、[13]、[14]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。大量研究表明，淀粉样纤维的形成是多肽骨架的普遍特性[28]、[29]。此外，纤维化过程受到多种外部因素的强烈影响，如蛋白质浓度、温度、pH值、搅拌、离子强度和压力[4]、[7]、[12]、[28]、[30]。

由于淀粉样变性与高发病率和死亡率相关，因此人们投入了大量精力来发现和开发抗淀粉样药物[8]。迄今为止，多种天然或合成化合物已被证明在体外或体内对淀粉样变性有效[1]、[19]。然而，目前尚无能够治愈这些疾病的药物[23]，现有的药物仅能提供轻微的症状缓解[11]。基于该领域的广泛研究，治疗淀粉样变性的方法通常分为四类：(i) 减缓纤维组装的形成，从而延缓疾病发作[19]、[22]；(ii) 抑制纤维结构的产生[1]、[21]、[22]、[30]；(iii) 破坏已形成的成熟纤维[17]、[21]、[30]；(iv) 捕获纤维组装[1]、[31]、[32]。在这些策略中，抑制纤维形成的方法明显优于破坏成熟纤维的方法[10]。然而，临床试验表明，许多抗淀粉样化合物具有毒性，并会对免疫系统产生显著影响。因此，探索新型有效且安全的淀粉样变性治疗方法仍然十分重要[8]、[17]。

胰岛素是一种在不稳定条件下会形成淀粉样纤维的蛋白质。胰岛素的纤维化在制造、纯化、长期储存以及药物制剂中的递送过程中带来了重大挑战[21]、[33]。经常注射胰岛素的1型糖尿病患者会在注射部位附近出现淀粉样沉积物，这导致了一种称为注射部位淀粉样变性的体内问题。这些胰岛素沉积物会失去生物活性，并可能引发不良的免疫反应[21]、[22]、[24]、[30]、[33]。

胰岛素是一种含有51个残基的肽类激素，由两条链（A链和B链）通过两个链间二硫键连接而成[22]、[29]。胰岛素的晶体结构显示由三个相同的二聚体组成的六聚体，这些二聚体围绕两个Zn²⁺离子排列。在每个单体中，A链和B链都采用紧凑的结构，具有不同的二级结构元素[34]。A链形成两个反平行的α螺旋，而B链由一个α螺旋、一个β转角和一个β折叠组成[29]、[35]。就四级结构而言，在中性pH值和锌离子存在的情况下，以及浓度高于10 μM时，胰岛素以六聚体形式存在[35]；相反，在酸性环境中，它以单体形式存在[30]。由于其体积小且处于亚稳态，胰岛素单体表面具有暴露的疏水区域[35]。因此，在高温、低pH值和搅拌条件下，胰岛素会因这些暴露区域的疏水相互作用而发生纤维化[29]、[36]。

研究表明，胰岛素的纤维化是通过寡聚体解离为单体来实现的。已经提出了几种纤维化模型[29]；其中最适用于胰岛素的模型是依赖成核的聚合模型[3]、[4]、[13]、[37]。在这个模型中，最小的单元由两个平行的β折叠片组成，称为原纤维[22]、[29]。这个小的核心是一个热力学上不稳定的中间体（ΔG° > 0），具有强烈的延长倾向[8]、[29]。原纤维通过单体与核心自由端的不可逆结合而延长。此外，胰岛素纤维从原纤维的组装过程基于分层组装模型（HAM）进行描述[15]：两个原纤维相互缠绕形成原纤维，然后两个原纤维结合形成I型纤维。II型纤维是由两个I型纤维相互缠绕形成的。原纤维组装成纤维的驱动力包括疏水相互作用和静电相互作用[15]。此外，依赖成核的聚合模型的动力学曲线呈S形，包括一个滞后阶段（成核）、一个最大生长阶段（延长）和一个稳定阶段（平衡）[2]、[12]、[16]、[30]。相比之下，无定形的玻璃状沉积物没有滞后阶段，并且形成速度很快。许多研究探讨了槲皮素[21]、大分子碳水化合物[7]、肽[33]、渗透压调节剂[25]、小分子荧光化合物[22]、[30]、姜黄素[30]、富勒烯C₆₀和C₇₀[38]、金纳米颗粒[36]以及磷脂酰胆碱衍生物表面活性剂[1]对胰岛素纤维化的影响。

尽管淀粉样纤维在体内会引起问题，但它们可以在体外用于纳米技术和生物技术应用。例如，在碳水化合物或其他添加剂的存在下，某些蛋白质衍生的淀粉样纤维的性质可以得到改善。这种方法可以生产出直径和稳定性可控的纳米线[7]、[15]、[18]。此外，已经使用Aβ（1–40）纤维制造出纳米管支架，这些支架在长期神经元培养中表现出良好的效果[10]。关于淀粉样纤维作为生物催化剂在水处理[39]、生物塑料生产[40]、组织工程、传感、药物递送[41]等相关领域的应用，可参考相关文献。

在我们之前的研究中，我们合成并研究了三种含有脲烷键和聚乙二醇（PEG）链段的季铵型 Gemini 表面活性剂[43]。它们之间的唯一区别是间隔基团（由亚甲基单元组成）的长度，分别表示为C_n表面活性剂（n=2、4和6）。这些基于脲烷的 Gemini 表面活性剂是使用异佛尔酮二异氰酸酯（IPDI）作为偶联剂，在二甲基乙醇胺（DMEA）和PEG链段之间合成的。所得到的 Gemini 分子在每条链上都有两个脲烷基团。这些基团促进了表面活性剂与蛋白质分子之间的氢键形成[44]，这对表面活性剂-蛋白质相互作用有益。此外，脲烷键具有抗水解性。因此，所得到的 Gemini 表面活性剂比缺乏此类基团的表面活性剂具有更高的水解稳定性。此外，PEG链段具有亲水性，通过微调整体HLB值来提高表面活性剂在水介质中的分散性[45]。PEG的柔性亲水外壳赋予了 Gemini 表面活性剂生物相容性。因此，这些表面活性剂具有生物相容性并且耐水解。这些 Gemini 表面活性剂在胰岛素存在下的CMC（临界胶束浓度）分别为25.9 μM、11.1 μM和15 μM。此外，使用CD光谱研究了这些表面活性剂对胰岛素二级结构的影响。观察到，与天然胰岛素相比，当C_n与蛋白质的摩尔比为5和10时，C₆表面活性剂分别使蛋白质的α-螺旋含量增加了6.6%和8%。当C₄表面活性剂的摩尔比为3时，α-螺旋含量增加了6%；而当C₂表面活性剂的摩尔比为7时，β-折叠结构增加了6%[43]。

在这项研究中，我们以胰岛素作为体外纤维形成蛋白的模型进行了研究。鉴于淀粉样纤维的二级结构以β折叠片为主，我们之前的研究结果表明这些 Gemini 表面活性剂可能会影响胰岛素的纤维化。C₆和C₄表面活性剂可能在特定的摩尔比（C₆:X=5和C₄:X=3）下抑制胰岛素的纤维化。这是因为这两种表面活性剂增加了蛋白质的α-螺旋含量。相反，C₂表面活性剂可能在X=7时促进胰岛素的纤维化。因此，我们进一步探讨了这一主题。首先，在没有表面活性剂的情况下使胰岛素纤维化，并对其纤维化动力学进行了彻底研究。随后，在指定的摩尔比下加入 Gemini 表面活性剂后重复实验。通过比较这两组实验的结果，可以揭示特定摩尔比下表面活性剂对胰岛素纤维化的影响。这项研究的独特之处在于这些 Gemini 表面活性剂是在我们的实验室合成的，此前尚未有人进行过关于胰岛素纤维化的类似研究。

材料

牛胰岛素（I6634，分子量5800 Da）和硫黄素T（ThT）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。含脲烷键和聚乙二醇（PEG）链段的阳离子 Gemini 表面活性剂在我们之前的工作中已经合成并进行了表征[43]。这些 Gemini 表面活性剂仅在间隔基团中的亚甲基单元数上有所不同（n=2、4、6），分别称为C₂、C₄和C₆表面活性剂。所有其他化学品均为分析级。

在没有 Gemini 表面活性剂的情况下牛胰岛素的纤维化

ThT是一种广泛用于识别淀粉样纤维的探针。它特异性地与淀粉样纤维的β-折叠结构相互作用，蛋白质序列对其结合几乎没有影响。因此，ThT荧光强度的增加被用作纤维形成的指标[1]、[4]、[13]、[17]、[20]、[21]、[25]、[26]。为了评估在没有 Gemini 表面活性剂（对照组）的情况下牛胰岛素的纤维化情况，观察了……

结论

胰岛素在酸性环境中以单体形式存在。在高温和搅拌条件下，这些单体在67小时内形成淀粉样纤维。在C₂、C₄和C₆脲烷-PEG Gemini 表面活性剂存在的情况下，胰岛素的纤维化也被研究了。结果表明，间隔基团的长度决定了抑制（C₄、C₆）和促进（C₂）纤维化之间的功能转换

CRediT作者贡献声明

Pouneh Sadat Pourhosseini：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法学设计、概念构思。Sara Fayazzadeh：实验研究。Ali Akbar Saboury：资源提供。Farhood Najafi：资源提供。Mina Evini：实验研究。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢伊朗国家科学基金会（INSF，授权号98007412）和阿尔扎赫拉大学研究委员会提供的财务支持。