《International Journal of Biological Macromolecules》：Bifidobacterium animalis RH exopolysaccharide bidirectionally modulates inflammatory bone metabolism disorders
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胞外多糖调节炎症性骨代谢疾病中成骨与破骨平衡的机制研究，通过抑制TLR4/NF-κB通路激活RUNX2信号轴促进成骨细胞功能，同时抑制MITF/PU.1/NFATc1转录网络调控破骨细胞分化。
作者：史书媛、杨泽谦、韩子欣、姚博清、李萍兰、尚楠
中国农业大学食品科学与营养工程学院功能乳品重点实验室，北京 100083
摘要
骨骼代谢的炎症失调是多种骨骼病理的基础，包括骨质疏松症、骨关节炎和假体松动。尽管益生菌代谢物具有多方面的营养益处，但基于双歧杆菌（Bifidobacterium）的胞外多糖的研究进展仍然有限。因此，我们从动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）RH中提取了胞外多糖（EPS，分子量为21.3 kDa），并探索了其在炎症性骨疾病中的治疗潜力及其机制。在体外模型中，我们使用了脂多糖（LPS）刺激的MC3T3-E1成骨细胞和RANKL诱导的RAW 264.7破骨细胞前体，并对其进行了不同浓度EPS的处理。EPS恢复了LPS受损的成骨细胞功能，增强了细胞增殖、分化、矿化和胶原蛋白合成。这一效果通过ALP活性升高、钙结节形成、胶原蛋白表达增加以及促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、IL-17a/f）分泌减少得到证实。EPS通过抑制TLR4/NF-κB通路和激活RUNX2转录来促进成骨作用。同时，EPS通过减少炎症细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）、抑制ROS生成、下调RANK表达以及破坏调控关键破骨细胞特异性基因（如TRAP、CTSK）的MITF/PU.1/NFATc1转录网络来抑制破骨细胞生成。本研究系统地阐明了EPS在炎症性骨疾病中的双重调节机制，突显了其在骨骼病理中的治疗潜力，并为开发体内模型和膳食生物疗法奠定了基础。
引言
炎症性骨疾病（如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、伴有慢性炎症的骨质疏松性骨折）属于免疫介导的代谢紊乱，其特征是骨吸收与骨形成之间的失衡，具有较高的全球发病率和致残率[1]、[2]。2020年，仅骨关节炎就影响了全球约5.95亿人（占全球人口的7.6%），比1990年增加了132.2%，成为劳动力损失和公共卫生负担的主要原因[3]。传统治疗方法存在显著局限性：长期使用非甾体抗炎药（NSAIDs）和皮质类固醇常导致胃肠道损伤、心血管风险和骨质流失[4]。虽然生物制剂（如TNF-α抑制剂）可以缓解症状，但仍有30-40%的患者反应不佳，并伴有感染和恶性肿瘤的风险[5]。此外，大多数现有疗法旨在防止疾病进展，但无法逆转已建立的骨微结构损伤，往往导致不可逆的缺陷[6]、[7]。因此，开发新型、具有成本效益的策略以减少炎症并促进骨再生对于降低致残率和改善患者生活质量具有紧迫的临床意义。
除了药物治疗外，研究方向转向了益生菌。研究表明，某些菌株（如植物乳杆菌CCFM1143、鼠李糖乳杆菌GG、罗伊氏乳杆菌ATCC PTA 6475、动物双歧杆菌lactis亚种A6、乳杆菌Probio-M8、凝结芽孢杆菌）能够通过影响肠道-骨骼轴来调节骨代谢[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。人群试验进一步表明，动物双歧杆菌Probio-M8通过增强矿物质代谢、减少全身炎症以及通过富集产生短链脂肪酸的细菌和上调与碳水化合物和脂质代谢相关的基因来缓解绝经后骨质疏松症[10]。然而，关于个体肠道定植的差异性、潜在的药物相互作用、菌群失调以及长期使用益生菌对免疫功能低下个体的安全性仍存在担忧。为克服这些限制，国际益生菌协会（IPA）将益生菌衍生的胞外多糖（EPS）视为稳定、安全且可靶向的后生物代谢物，认为它们是下一代微生态干预的有希望的组成部分[14]。EPS具有强烈的抗炎、抗氧化和免疫调节活性[15]；然而，它们在骨代谢中的潜在作用仍大部分未被探索[16]、[17]。
在本研究中，从中国白马地区的百岁老人粪便中分离出了动物双歧杆菌RH，并提取了其EPS。基于先前关于其强抗氧化活性的研究结果[18]、[19]，建立了成骨细胞和破骨细胞的炎症性骨微环境体外模型。本研究旨在阐明EPS对骨代谢的双重调节作用和机制，从而开发出一种结合强抗炎作用、促进骨再生和成本效益的新治疗策略，以降低致残率并改善患者生活质量。
材料与试剂
小鼠胚胎成骨细胞前体（MC3T3-E1）和单核巨噬细胞白血病细胞（RAW 264.7）购自国家生物医学实验室细胞库。α-最小必需培养基（α-MEM）、Dulbecco改良 eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素和胰蛋白酶-EDTA购自Gibco（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。脂多糖（LPS）、α-抗坏血酸、β-甘油磷酸和地塞米松购自Sigma（美国）。
EPS通过调节转录因子（RUNX2）和下游基因（COL1A2）恢复LPS诱导的成骨功能障碍
浓度为12.5–200 μg/mL的EPS显著促进了MC3T3-E1细胞的增殖，这一效果从第1天开始就很明显，并持续了7天（图1A）。因此，选择12.5–200 μg/mL的浓度范围进行初步实验。
在3天、5天和7天的ALP活性实验中，添加1 μg/mL的LPS有效抑制了MC3T3-E1细胞的ALP活性（比对照组低50%以下）。
讨论
本研究表明，来自动物双歧杆菌RH的胞外多糖（EPS）对炎症性成骨细胞和破骨细胞具有双重调节作用，有效缓解了炎症性骨代谢紊乱和相关的骨溶解。虽然益生菌EPS的研究主要集中在乳酸菌上，但对双歧杆菌EPS的体外研究主要集中在免疫调节、抗炎和抗氧化活性上[28]、[29]、[30]。
结论
总之，本研究阐明了胞外多糖（EPS）在炎症性骨代谢紊乱中的双重调节作用，并揭示了其背后的分子机制。在成骨细胞中，EPS通过调节RUNX2信号通路并抑制TLR4/NF-κB通路的激活来缓解LPS诱导的炎症微环境并促进细胞成熟。在破骨细胞中，EPS通过RANK轴抑制关键转录因子（NFATc1、PU.1、MITF），从而减轻RANKL诱导的炎症。
作者贡献声明
史书媛：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、研究、数据分析、概念化。
杨泽谦：可视化、方法学、研究、概念化。
韩子欣：撰写 – 审稿与编辑。
姚博清：可视化、方法学。
李萍兰：监督、项目管理、研究、概念化。
尚楠：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、研究、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（批准号：32201994）的支持。
