来自Thermococcus kodakarensis的L-天冬酰胺酶关键残基取代物的生化特性及其在丙烯酰胺降解中的应用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Biochemical insights into the key residue substituents of an L-asparaginase from Thermococcus kodakarensis and their application in acrylamide mitigation

本研究开发了一种dextran修饰的微生物泡沫纤维素水凝胶，结合毛藻提取物显著促进表皮细胞增殖和水合作用，小鼠体内实验显示其有效促进伤口修复，形成正常表皮结构，为新型湿润敷料奠定基础。

　　

林信萍|易宗凯|高逸峰|涂明杰|谢陈澈|沈祖川|周玉洁|卢正杰|佩尔马塔萨里·桑托索（Shella Permatasari Santoso）|蔡慧珍|郑宽辰

台北医学大学食品安全学院，台湾台北11042

摘要

在这项研究中，我们开发了一种右旋糖酐改性的泡沫细菌纤维素（FBC）水凝胶，该水凝胶在制备过程中使用了含有右旋糖酐的泡沫介质。与未经改性的FBC相比，这种右旋糖酐/FBC水凝胶具有更高的水分含量（92.3%–94.2%），并且能够促进上皮细胞的增殖（未经改性的FBC为79.1% vs 68.4%）。此外，将右旋糖酐/FBC与Botryocladia leptopoda提取物（AE）结合使用后，细胞增殖率进一步提高至97.1%。在小鼠体内的伤口愈合实验中，含有AE的右旋糖酐/FBC显示出最佳的伤口重塑效果：在第12天时，表皮厚度恢复正常，孔隙和毛囊等功能性结构也得到了再生。这种生物材料可以直接通过微生物生物合成获得，无需后续修饰。其可生物降解性、可持续的绿色生产过程以及出色的伤口重塑能力使其成为一种新型湿润伤口敷料的潜在候选材料。

引言

伤口愈合是一个复杂的过程，涉及多种细胞、细胞外成分和结构之间的相互作用[1]。不同类型的伤口需要不同的护理措施，例如加速伤口愈合、防止病原体感染、减轻疼痛以及避免过多的组织液从伤口渗出[2]。尽管多年来药物一直与敷料结合用于伤口护理，但这些药物往往具有不良副作用[3]。因此，人们越来越关注基于天然活性化合物的伤口愈合剂和敷料的开发。 Botryocladia leptopoda是一种红色大型藻类，其特点是具有颗粒状、类似葡萄的形态[4]。它因其营养价值和多种生物活性而受到关注，包括强大的抗氧化能力[5]和抗糖尿病活性[6]，以及抗炎作用，并能在特定细胞模型中增强细胞粘附和增殖[6][7][8]。这些特性表明B. leptopoda提取物是开发支持组织再生和伤口修复的治疗性制剂的有希望的候选物质。然而，将其纳入适合体内伤口愈合应用的生物材料支架中仍存在局限性。 细菌纤维素（BC）因其高水分含量[9]、良好的生物相容性[10]、可生物降解性[11]和优异的机械性能[12]而常被选为伤口敷料材料[13]。然而，BC缺乏促进伤口愈合所需的生物功能，如抑制伤口炎症和防止疤痕形成。因此，为了在伤口敷料中有效使用，需要对BC进行改性以赋予其必要的生物功能。BC最常见的改性方法是原位和体外改性方法，这两种方法主要涉及将改性剂物理嵌入其纳米纤维或网状结构中。这种机制与传统的化学交联方法有本质区别，因为改性剂是在纤维素组装过程中交织或整合到其多孔结构中，而不是通过共价键连接[14][15]。这两种方法都需要将改性物质以液态形式掺入BC结构中才能实现有效的改性。然而，BC的致密结晶纳米纤维网络和较差的吸水性能常常限制了改性效果，阻碍了生物活性物质的有效掺入，也限制了细胞向支架中的渗透，这对其在伤口护理中的应用构成了挑战[15]。为了克服这一限制，可以在泡沫培养基中生产BC，从而获得多孔泡沫BC（FBC）[16]。FBC生产系统在原位改性过程中具有更高的掺入效率[16]，这归功于其优异的吸水能力和机械强度[17]。尽管如此，FBC作为载体用于结合海洋藻类提取物在伤口愈合应用中的潜力尚未得到充分探索。

我们之前的研究使用交联右旋糖酐与BC结合，形成右旋糖酐改性的BC，发现这种组合可以加速小鼠模型中的伤口愈合过程[18]。这些结果表明右旋糖酐具有促进伤口愈合的效果。在本研究中，我们旨在通过原位改性方法将右旋糖酐掺入FBC中，以制备右旋糖酐/FBC复合膜。为了进一步提高伤口愈合效果，还加入了Botryocladia leptopoda提取物。传统BC的致密纤维结构常常阻碍治疗剂或功能性成分的有效加载。然而，本研究中使用的FBC显著改善了这一限制。因此，该策略有助于创建一个多功能、完全天然的伤口护理平台，弥合了微生物纤维素的结构稳定性和海洋成分的治疗效果之间的差距。通过利用FBC独特的多孔结构，这项工作为原位改性生物材料建立了新的范式。我们对所得复合材料的性能进行了系统评估，涵盖了材料、细胞和生理层面，以证明其作为先进伤口敷料的适用性。

材料与化学品

本研究中使用的微生物是Komagataeibacter sucrofermentans ATCC 700178（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。NIH-3 T3成纤维细胞来自台湾新竹的生物资源收集与研究中心。EDTA、胰蛋白酶和抗生素（青霉素/链霉素）由GE Healthcare Life Science（美国犹他州洛根）提供。细胞培养基（Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM）和胎牛血清（FBS）由Hyclone Laboratories（美国犹他州洛根）提供。

右旋糖酐/FBC的制备

FBC的制备参数对于确定特定应用中原位改性的可行性至关重要。图1a显示，0.25%、0.5%、0.75%、1%和1.25%的右旋糖酐/FBC样品的产量分别为12.02、11.90、12.81、15.08和12.55克/升，而对照组为10.54克/升。其中1%右旋糖酐/FBC的产量提高了约43%。然而，统计分析表明这些组间没有显著差异。

结论

总结来说，我们成功开发了一种原位改性的FBC水凝胶，该水凝胶具有高水分含量，并且有利于上皮细胞的粘附和增殖。将右旋糖酐/FBC与B. leptopoda提取物结合使用后，进一步增强了伤口愈合能力。体内研究表明，未经处理的伤口虽然能够快速闭合，但会导致皮肤异常增厚和愈合过程延长。经过水凝胶处理的伤口受益于湿润的环境，这促进了细胞的生长和修复。

CRediT作者贡献声明

林信萍：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，验证，监督，概念构思。 易宗凯：数据管理，概念构思。 高逸峰：数据管理，概念构思。 涂明杰：数据管理，概念构思。 谢陈澈：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。 沈祖川：方法学研究。 周玉洁：验证，方法学研究。 卢正杰：方法学研究。 佩尔马塔萨里·桑托索：撰写 –

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC 112-2221-E-002-040-MY3、NSTC 112-2320-B-002-013-MY3、NSTC 113-2321-B-002-037和NSTC114-2221-E-038-004）以及台湾农业部渔业研究所（112AS-6.3.1-AI-A1和113AS-6.3.1-AI-01）的资助。