YTHDF2通过依赖m6A的SMAD7降解以及PRR5逃避降解过程，促进砷的致癌作用

《International Journal of Biological Macromolecules》：YTHDF2 promotes arsenic carcinogenesis through m6A-dependent SMAD7 decay and PRR5 escape from decay

YTHDF2通过调控m6A修饰的PRR5和SMAD7促进砷致癌，揭示m6A甲基转移酶METTL3和去甲基酶FTO在 arsenic诱导的恶性表型中的动态平衡作用。

　　

钱张|金曼|蔡静琳|赵天和|张尊珍

四川大学公共卫生西华学院与西华第四医院环境与职业健康系，中国四川成都610041

摘要

YTH结构域家族蛋白2（YTHDF2）是一种促进m6-甲基腺苷（m6A）降解的结合蛋白，它作为m6A甲基转移酶和去甲基酶下游的关键效应因子，决定了修饰mRNA的命运。然而，YTHDF2与m6A甲基转移酶/去甲基酶之间的相互作用如何调控砷的致癌作用尚不清楚。在本研究中，我们通过体外（人角质形成细胞暴露于1 μM亚砷酸盐24周）和体内（小鼠每天暴露于10 mg/kg的亚砷酸盐12周）模型，发现YTHDF2通过激活促癌信号通路并抑制抗癌信号通路来促进砷的致癌作用，这一过程依赖于m6A修饰。整合多组学分析（包括时间序列mRNA测序、MeRIP测序以及YTHDF2靶点的计算预测）确定了PRR5和SMAD7是参与砷致癌作用的关键YTHDF2相关转录本。角质形成细胞中的m6A水平在24周内增加了2.38倍，在小鼠皮肤中增加了3.22倍。机制上，m6A甲基转移酶METTL3通过增加SMAD7转录本上的m6A含量，增强了YTHDF2对SMAD7 mRNA的降解作用。相反，m6A去甲基酶FTO减少了PRR5上的m6A含量，从而减弱了YTHDF2的结合，使PRR5能够逃避YTHDF2的降解并积累。位点特异性的SELECT-qPCR进一步验证了PRR5的1347位点和SMAD7的2441位点的m6A动态重塑。功能上，YTHDF2在角质形成细胞中促进了恶性表型，并加剧了小鼠中的砷诱导皮肤病变，同时激活了PRR5-mTORC2-AKT通路并增强了SMAD2/3信号通路。本研究加深了我们对对立的m6A调控轴如何影响YTHDF2的结合及mRNA降解结果的理解，进而通过调控致癌和抑癌信号通路促进了砷的致癌作用。

引言

m6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最丰富且动态调控最强烈的RNA表观遗传修饰，它通过一种可逆的“写入-擦除-读取”机制精细调控整个RNA生命周期，从合成到降解[1]。特定转录本上的m6A水平由甲基转移酶（“写入者”）和去甲基酶（“擦除者”）动态调控，而m6A结合蛋白（“读取者”）则识别m6A标记以决定RNA的命运[2]。YTH结构域家族蛋白2（YTHDF2）是最早被发现的m6A结合蛋白之一，它通过其YTH结构域识别m6A位点并招募CCR4-NOT去腺苷化酶复合物来促进mRNA降解，该复合物在包括肿瘤发生在内的多种生物过程中起着关键作用[3]。

传统上，YTHDF2在肿瘤发生中的作用取决于m6A修饰靶点的生物学功能。一项研究表明，METTL14依赖的m6A在促转移因子SOX4上的沉积促进了YTHDF2的识别及随后的SRY-box转录因子4（SOX4）mRNA降解，从而抑制了结直肠癌（CRC）的侵袭和转移[4]。相反，另一项研究表明，m6A去甲基酶ALKBH5去甲基化了致癌蛋白Rab-5A（RAB5A），减弱了YTHDF2介导的降解作用，导致RAB5A积累，进而促进了CRC的进展[5]。这些研究表明，YTHDF2在癌症进展中的最终功能既取决于其靶点的生物学功能，也取决于上游m6A甲基转移酶和/或去甲基酶的精确调控。因此，探索YTHDF2与上游m6A调控因子之间的相互作用对于准确理解其在癌症生物学中的作用至关重要。

越来越多的证据表明，m6A依赖的转录后调控参与了环境致癌物诱导的恶性转化[6],[7],[8]。砷是一种广泛存在的环境致癌物，与多种癌症有明确的因果关系[9]。尽管正在努力减少饮用水中的砷暴露，但砷暴露带来的健康危害仍然是一个重要的公共卫生问题[10],[11]。关键的是，砷诱导的恶性转化不仅需要癌变信号通路的异常激活，还需要肿瘤抑制屏障的同时失活[12]。最近的研究表明，YTHDF2降解了抑癌因子PH结构域富含亮氨酸重复序列蛋白磷酸酶2（PHLPP2）的m6A修饰mRNA，从而促进了砷诱导的恶性转化[13]。同样，我们之前的研究表明，敲低YTHDF2通过抑制YTHDF2介导的肿瘤抑制因子p53诱导死亡结构域1（PIDD1）的降解，减轻了砷诱导的过度增殖、侵袭能力和抗凋亡抵抗力[14]。虽然这些研究表明YTHDF2在砷致癌作用中的关键作用，但仅关注单一靶点的机制无法完全解释砷如何同时激活促癌信号通路和抑制抗癌信号通路。YTHDF2与其上游m6A调控因子之间的协同网络如何介导癌变信号的激活和肿瘤抑制信号的抑制，在砷诱导的转化过程中仍不清楚。

在本研究中，我们利用体外和体内砷致癌模型探讨了YTHDF2是否通过m6A介导的mRNA命运调控来促进砷的致癌作用。整合多组学分析确定了PRR5和SMAD7是参与砷致癌作用的关键YTHDF2相关靶点。机制上，METTL3增强了m6A的沉积，使SMAD7易于被YTHDF2降解；而FTO依赖的m6A从PRR5上的去除减弱了YTHDF2的结合，使PRR5能够逃避YTHDF2的降解并积累。METTL3驱动的SMAD7丢失和FTO驱动的PRR5逃避YTHDF2介导的降解随后激活了PRR5-mTORC2-AKT通路，并由于SMAD7的丢失增强了SMAD2/3信号通路，共同促进了砷诱导的恶性表型。总体而言，本研究从YTHDF2/m6A介导的mRNA降解的角度提供了关于砷致癌性的新见解。

细胞培养和试剂

永生化的人角质形成细胞HaCaT是一种成熟的模型，用于研究砷诱导的皮肤癌变[15],[16],[17]。293T细胞系用于慢病毒包装。这两种细胞系均来自KeyGen Biotechnology（中国南京），并在含有胎牛血清、青霉素和链霉素的高葡萄糖DMEM培养基（Servicebio，武汉，中国）中培养。培养条件为37°C、5% CO2的湿润培养箱。

YTHDF2促进砷诱导的角质形成细胞恶性转化

为了确定YTHDF2在慢性砷暴露下角质形成细胞恶性转化中的致癌作用，我们建立了一个YTHDF2过表达的HaCaT模型。具体来说，HaCaT细胞被转导了编码野生型YTHDF2与绿色荧光蛋白（GFP）融合的慢病毒载体。然后将这些细胞持续暴露于1 μM亚砷酸盐24周，以生成砷诱导的癌变细胞模型（图1a）。免疫印迹实验（图S1）显示...

砷诱导转化过程中YTHDF2介导的mRNA降解机制

砷是一种公认的环境致癌物，国际癌症研究机构将其归类为人类致癌物[9],[49],[50],[51]。据估计，全球有1.4亿人长期暴露于浓度超过世界卫生组织（WHO）建议的10 μg/L的受污染饮用水中[52],[53],[54]。元分析数据显示，饮用水中每增加10 μg/L的砷，相对风险增加8%-23%

局限性与未来方向

尽管本研究系统分析了YTHDF2-m6A轴在砷致癌中的作用，但我们仍存在一些局限性。首先，虽然我们通过体外拯救实验验证了PRR5和SMAD7的功能，但由于慢性暴露模型的复杂性，我们没有进行体内拯救实验来验证PRR5积累和SMAD7丢失对砷诱导皮肤病变的因果必要性。其次，一个尚未解决的关键问题是慢性砷暴露如何同时...

CRediT作者贡献声明

钱张：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。金曼：验证、方法学。蔡静琳：验证。赵天和：撰写——审稿与编辑。张尊珍：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC，项目编号：82073510）对张尊珍的资助。

未引用的参考文献

[61],[62]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。