具有微环境响应性和一氧化氮（NO）缓释功能的 hydrogel 通过抑制细菌生长和促进血管生成来加速感染伤口的愈合

《International Journal of Biological Macromolecules》：Microenvironment-responsive and NO sustained-release hydrogel accelerates infected wound healing by bacteriostasis and angiogenesis

本研究开发了一种微环境响应型Na Alginate (SAZA) 水凝胶，通过ZnO2纳米颗粒在酸性伤口环境中释放H2O2和Zn2+，与L-Arg发生级联反应持续释放NO，协同增强抗菌活性，同时促进细胞迁移和血管生成，加速感染性伤口愈合。

　　

刘永哲|马丽|张熙照|张一飞|王子伟|赵宏霞|詹龙轩|孔颖|曾明华|马晓妮|马宝金

山东大学齐鲁医学院口腔学院及附属医院种植学与组织工程与再生科，山东省口腔组织再生重点实验室，山东省牙科材料与口腔组织再生工程实验室，山东省口腔疾病临床研究中心，济南，250012，中国

摘要

感染性伤口由于持续感染、慢性炎症、血管生成不足和组织再生受损而带来显著的临床挑战。一氧化氮（NO）在感染性伤口愈合中最近受到了广泛关注。然而，实现微环境响应性和持续释放NO仍然具有挑战性。在这项研究中，我们开发了一种微环境响应性的海藻酸钠（SAZA）水凝胶，其中负载了ZnO₂纳米颗粒（NPs）和L-精氨酸（L-Arg）。在感染性伤口的酸性微环境中，SAZA水凝胶中的ZnO₂ NPs发生水解，释放出H₂O₂和Zn²⁺，随后H₂O₂与L-Arg发生级联反应生成NO，从而既提高了治疗效果，又延长了治疗效果。此外，Zn²⁺增加的膜通透性促进了NO进入细菌细胞，导致DNA损伤和代谢抑制。在这种协同作用下，SAZA水凝胶表现出更强的抗菌活性。同时，SAZA水凝胶还促进了细胞迁移和血管生成，并具有良好的生物相容性。体内实验进一步证实，SAZA水凝胶能够减轻小鼠感染性伤口的感染和炎症，并通过促进血管生成和胶原沉积加速伤口愈合。通过结合强大的抗菌活性和改善的组织修复能力，这种具有NO持续释放功能的多功能水凝胶为治疗感染性伤口提供了有前景的策略。

引言

感染性伤口是临床实践中常见且复杂的病理状况，严重影响患者的生活质量并增加医疗负担[1,2]。在正常情况下，伤口愈合是一个高度调控的多阶段过程，包括止血、炎症、增殖和重塑[3]。然而，当伤口被病原微生物感染时，会触发体内的炎症免疫反应。这种失调的炎症反应会抑制组织修复和血管生成，可能导致伤口愈合在炎症阶段停滞很长时间[4]。此外，身体的免疫系统往往无法及时有效地清除细菌，任何逃逸清除的细菌都会分泌胞外多糖基质（EPS）并形成生物膜，保护病原体免受宿主免疫系统和抗生素治疗的影响[5,6]，这使得根除感染性伤口的初始因素变得更加困难，可能导致更严重的并发症，如慢性不愈合溃疡或败血症[7,8]。随着细菌耐药性的持续恶化，传统抗生素治疗感染性伤口的效果也在逐渐下降[9]。因此，开发具有抗菌作用、抗生物膜能力和促进组织修复能力的新疗法已成为感染性伤口治疗领域的主要研究方向。

一氧化氮（NO）是一种内源性气体分子，在细胞间信号传导和生理调节中起着关键作用[11]。研究表明，NO可以破坏细菌的遗传物质、细胞膜和正常细菌功能[12]。NO还可以穿透并破坏EPS[13]，表现出对生物膜的广谱抑制作用[14]。此外，NO可以刺激内皮细胞和成纤维细胞的增殖和迁移，促进血管生成和胶原沉积，并驱动巨噬细胞向M2表型极化[[15], [16], [17], [18]]。这有助于减少炎症并促进组织和血管的修复。L-精氨酸（L-Arg）是人体内NO的前体，具有优异的生物相容性[19]，并且在H₂O₂水平升高时可以被催化生成NO[20]。尽管已经提出了一些通过使用CaO₂[21]和加载葡萄糖氧化酶（GOx）[22,23]来提高局部H₂O₂浓度以实现NO有效释放的有希望的策略，但CaO₂的快速水解和GOx的失活通常无法持续提供H₂O₂。ZnO₂是一种在水溶液中相对稳定的金属过氧化物[24]，在酸性环境中能够持续释放Zn²⁺和H₂O₂。此外，与其他常用的抗菌金属离子（如铜和银）相比，Zn²⁺对细胞的毒性较低[25]。因此，L-Arg和ZnO₂的组合为治疗感染性伤口提供了一种有吸引力的策略。

基于天然生物分子的水凝胶由于其优异的生物相容性、支持湿润环境的能力和良好的药物装载能力，被广泛用作伤口敷料[26]。它们是有效的药物递送平台[27]。当前先进的水凝胶策略通常专注于递送复杂的生物制剂或响应刺激的材料[28]。例如，负载生长因子、核酸（如siRNA、miRNA）或外泌体的水凝胶能够精确调节特定的愈合途径[[29], [30], [31], [32]]，而结合响应刺激的纳米材料或特定水凝胶设计的系统则提供了复杂的时空控制[30,33,34]。然而，这些试剂的转化潜力可能受到固有的不稳定性[35]、复杂的制造过程[36]和高生产成本[37]的限制。在这方面，我们的策略具有某些优势：它使用稳定的化学前体（ZnO₂和L-Arg）在原位生成NO，与依赖生物制剂的系统相比，提供了更高的稳健性和简化了转化过程。在水凝胶基质中的封装对于实现这种设计至关重要。它确保了可控的长期释放曲线，以克服NO的高扩散性和短半衰期[38]。此外，这种纳米复合结构稳定了嵌入的纳米颗粒，调节了离子释放，提高了生物相容性，并增强了敷料的机械强度，符合先进治疗水凝胶的设计原则[39]。基于我们之前的工作，我们采用了一种均匀不饱和交联策略[40]，制备了一种可注射的海藻酸钠（SA）水凝胶，作为一种稳定且生物相容的递送平台。

受上述设计概念的启发，我们开发了一种微环境响应性的海藻酸钠（SAZA）水凝胶，其中负载了ZnO₂和L-Arg，以实现NO的持续释放，从而促进感染性伤口的愈合（图1）。感染性伤口通常表现为局部酸中毒（pH 5.5–6.5）[41,42]，SAZA水凝胶被专门设计为响应这种酸性微环境[43]。在这种水凝胶中，ZnO₂发生水解，释放出H₂O₂和Zn²⁺。生成的H₂O₂随后与L-Arg反应生成NO。此外，ZnO₂的分解行为在生理条件（PBS，pH 7.4）下表现为持续且缓慢的释放，而在酸性环境中则显著加速。这种pH依赖性的动力学特性使水凝胶能够根据需要自主触发治疗作用，从而与伤口的动态生理状态保持一致。由于Zn²⁺会破坏细胞膜磷脂和膜蛋白，NO可以更容易地穿透细胞并损伤遗传物质[44]，从而有效发挥协同杀菌作用。作为伤口敷料，SAZA水凝胶表现出合适的流变特性和可注射性。体外实验证实了其良好的抗菌和抗生物膜特性，以及促进细胞增殖、迁移和血管生成的能力。令人鼓舞的是，体内研究进一步验证了SAZA水凝胶在感染性伤口愈合过程中表现出良好的抗菌活性，促进了血管生成和胶原沉积，下调了炎症因子的表达，抑制了巨噬细胞向M1表型的极化，并显示出令人满意的生物相容性。总之，这种可注射的水凝胶敷料为感染性伤口的管理提供了一种有潜力的治疗策略。

材料

海藻酸钠（分子量：20–50 kDa，M: G = 1:1，粘度：15–60 mpa·s）、氯化钙（CaCl₂·2H₂O）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、醋酸锌二水合物（Zn (CH₃COO)₂·2H₂O）和L-Arg均从Macklin（上海，中国）购买。氨烷宁溶液（G1062）、H₂O₂检测试剂盒（BC3590）和ATP含量检测试剂盒（BC0300）从Solarbio（北京，中国）获得。脑心浸液琼脂（HB8478）和脑心浸液肉汤（HB8297-1）从HopeBio（青岛）购买。

ZnO₂ NPs的合成与表征

首先，使用Zn (CH₃COO)₂·2H₂和H₂O₂作为原料，PVP作为稳定剂，通过水热法合成了ZnO₂ NPs（图S1）。透射电子显微镜（TEM）图像（图1A）显示ZnO₂ NPs呈均匀球形，平均粒径约为55 nm（图S2）。X射线衍射（XRD）分析（图1B）确认了ZnO₂的特征立方结构，主要衍射峰与标准JCPDS卡片No. 13-0311中的峰匹配[47]。

结论

总之，本研究开发了一种微环境响应性的SAZA水凝胶，其中负载了ZnO₂和L-Arg，实现了NO的持续释放，用于治疗感染性伤口。该系统被设计为响应酸性伤口环境，在这种环境中ZnO₂发生水解，释放出H₂O₂和Zn²⁺；生成的H₂O₂随后与L-Arg发生级联反应生成NO，使SAZA水凝胶同时具备微环境响应性和延长的治疗效果。

作者贡献声明

刘永哲：撰写——原始草稿，可视化，项目管理，调查，正式分析，数据管理。 马丽：撰写——审阅与编辑，可视化，方法学，正式分析。 张熙照：撰写——审阅与编辑，可视化，方法学，正式分析。 张一飞：可视化，软件，方法学。 王子伟：软件，方法学。 赵宏霞：软件，方法学。 詹龙轩：软件，方法学。 孔颖：软件，方法学。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82471030和32301207）和山东省“泰山学者”建设工程专项基金（编号：tsqn202211327和tstp20250510）的支持。