工程学：利用Halomonas bluephagenesis菌实现丙酮酸的高效生物合成

《Metabolic Engineering》：Engineering Halomonas bluephagenesis for High-Efficiency Biosynthesis of Pyruvate

丙酮酸生物制造研究中，通过代谢工程优化极端嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01，在非无菌开放式分批发酵中实现39g/L丙酮酸产量，同时提升聚羟基烷酸酯（PHA）转化效率和乙醛酸合成能力，展示其作为下一代工业生物技术（NGIB）优良底盘潜力。

　　

王康|张宗浩|张中南|吴福清|陈国强

清华大学生命科学学院，北京100084，中国

摘要

丙酮酸作为一种C3平台化合物，在多个领域具有广泛的应用，包括生物基材料（例如聚乳酸）、药物中间体（如L-丙氨酸）和食品添加剂。与传统的石油基方法相比，通过微生物发酵进行生物制造可以提供可再生的原料和更清洁的生产过程。本研究探讨了极端嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01作为丙酮酸生产的底盘生物的潜力。为了提高丙酮酸的产量，采用了多种工程策略，包括阻断主要的碳消耗途径、消除丙酮酸的旁路降解、降低三羧酸循环的活性、去除甘油酸循环、调节转录因子以及减少丙酮酸的再吸收和利用。经过改造的H. bluephagenesis TD1.24在50小时的非无菌分批发酵中产生了39克/升的丙酮酸。同时，这种高产丙酮酸的菌株还表现出改善的PHB转化率和高效的乙酰醇合成能力。H. bluephagenesis作为下一代工业生物技术（NGIB）的底盘生物显示出强大的适应性，能够生产其自身的生物产物以及更广泛的生物制品。

引言

丙酮酸是糖酵解的最终产物，在生物碳代谢中起着关键作用。它参与三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化过程，从而为细胞提供能量。此外，丙酮酸还是多种生物分子合成的重要前体，在调节碳代谢以维持细胞代谢稳态方面发挥着重要作用（Soma等人，2022年；Zhang等人，2020b年）。

丙酮酸的主要化学合成方法涉及酒石酸的脱水和脱羧（Yuan等人，2022年）。这一过程需要高温蒸馏进行纯化，导致能耗高、安全隐患大且对环境有负面影响。因此，利用生物技术进行丙酮酸生产成为了一种有前景的替代方案。用于丙酮酸生产的微生物来源于多种菌株，主要包括大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、脂肪分解酵母和酿酒酵母。在大肠杆菌中，通过基因敲除抑制丙酮酸的分解代谢可以将丙酮酸浓度提高到35克/升（Tomar等人，2003年）。通过删除四个基因（aceF、pfl、poxB和pps），改造后的E. coli在分批发酵中可以产生90克/升的丙酮酸（Zhu等人，2008年）。调节细胞内的氧化还原状态是提高E. coli中丙酮酸浓度（93克/升）的有效方法（Liu和Cao，2018年）。Candida glabrata通过糖酵解途径高效地将葡萄糖转化为丙酮酸。通过操纵ATP酶促进菌株从氧化磷酸化向底物水平磷酸化的转变（Liu等人，2006年）或引入缺氧诱导因子（HIF1），丙酮酸浓度可达到约50克/升。尽管Candida glabrata具有生产丙酮酸的潜力，但其对人类的致病性限制了其工业应用（Chew等人，2021年）。除了上述典型微生物外，还有一些其他菌株也可以用于生产丙酮酸。Klebsiella oxytoca可以利用葡萄糖或乳清粉作为底物，生产出60至70克/升的丙酮酸（Cao等人，2020年）。Lactococcus lactis和Pseudomonas putida也被用作丙酮酸生物制造的潜在底盘生物（Sanchez-Pascuala等人，2019年；Zhao和Solem，2024年）。

在开发能够生产丙酮酸的工程菌株方面取得了显著进展，尤其是在提高产物浓度、底物利用效率和工程方法方面。然而，仍存在一些挑战，包括副产物形成的调控、代谢失衡的解决以及产物毒性的降低（Matsumoto等人，2017年）。在高产物浓度、极端pH值或高渗透压的环境中，菌株的稳定性仍需进一步优化（Gambacorta等人，2020年；Wan等人，2024年）。Halomonas bluephagenesis特别适应在高盐碱性环境中生长（Tan等人，2011年）。其高效的碳代谢通量聚集能力在生物塑料聚羟基烷酸酯（PHA）的合成中尤为突出（Jiang等人，2017年；Ling等人，2018年；Ye等人，2018a年），其对多种化合物的高耐受性也使其具有显著的底盘优势（Zhang等人，2020a年）。

为了在工业发酵生产丙酮酸方面与传统化学合成方法竞争，发酵过程中的一些关键指标必须达到高水平，包括浓度（>50-100克/升）、产率（>0.6-0.8克/克葡萄糖）和生产力（>0.55克/升/小时）（Konzock和Nielsen，2024年；Tan等人，2026年）。我们的H. bluephagenesis平台的独特价值在于它能够在不单独超越所有无菌工艺标准的情况下，通过一个简化且稳健的工艺框架实现具有工业竞争力的丙酮酸生产指标。这得益于节省成本的开放式非无菌发酵，减少了污染风险，允许使用替代底物，并最小化了pH控制干预（Ji等人，2023年；Yuan等人，2025年）。虽然需要进行完整的生命周期评估以进行精确比较，但该平台通过使用可再生原料和较温和的操作条件本质上符合可持续制造的宗旨。本研究采用了多种策略来重新定向碳通量以增强丙酮酸的积累，利用了H. bluephagenesis的代谢途径网络。通过实施转运蛋白工程，将丙酮酸的再利用与细胞生长分离，显著提高了丙酮酸的发酵浓度。最终的改造H. bluephagenesis菌株在开放的非无菌分批发酵条件下实现了高丙酮酸浓度。

部分内容摘录

菌株、质粒和培养基

本研究中使用的细菌菌株和质粒详见表S1。E. coli S17-1 λpir在Luria-Bertani（LB）培养基中培养，而H. bluephagenesis通常在LB60培养基中生长（胰蛋白胨10克/升、酵母提取物5克/升、NaCl 60克/升）。所有菌株均在37°C下培养，并根据需要添加抗生素（卡那霉素50微克/升、氯霉素25微克/升、壮观霉素100微克/升）。MM培养基的成分包括（克/升）：酵母提取物1、尿素0.6、MgSO₄ 0.2、Na₂HPO₄·12H₂O 9.65、KH₂PO4 1.5，

构建用于丙酮酸积累的H. bluephagenesis菌株

H. bluephagenesis对高渗透压具有天然耐受性，并能高效地将碳代谢通量导向聚羟基烷酸酯（PHA）的合成（Tan等人，2011年；Wang等人，2021年；Ye等人，2018a年）。这些特性使其成为生产细胞外小分子化合物的理想底盘生物，尤其是与碳代谢网络相关的化合物。使用H. bluephagenesis TD1.0（Zhao等人，2017年）作为摇瓶培养中的微生物菌株，

讨论与结论

嗜盐菌Halomonas bluephagenesis通过综合代谢工程方法被开发为一种高效的丙酮酸生产菌株。

用于丙酮酸生产的生长过程中的菌株来源于多种微生物，包括大肠杆菌（Tomar等人，2003年；Zhu等人，2008年）、酿酒酵母（Wang等人，2015年）和谷氨酸棒状杆菌（Kataoka等人，2019年；Wieschalka等人，2012年）等。

CRediT作者贡献声明

张中南：验证、正式分析。吴福清：资源、项目管理。王康：写作——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、正式分析、数据管理、概念构思。张宗浩：验证、研究、正式分析。陈国强：写作——审阅与编辑、资源管理、项目管理、研究、资金获取、正式分析、概念构思

未引用的参考文献

Silva-Rocha等人，2013年；Simon等人，1983年；Sun等人，2023年。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

所有其他作者声明在本研究中没有利益冲突。

致谢

本研究得到了先进材料-国家科技重大专项（2025ZD0614700）的财政支持。作者感谢Victor de Lorenzo教授慷慨提供pSEVA质粒系列。