动物膳食通过饲料中添加旧食品（FFPs）接触甲基黄嘌呤的风险评估

《ACS Agricultural Science & Technology》：Animal Dietary Exposure to Methylxanthines through the Inclusion of Former Food Products (FFPs) in Feed

本文系统评估了旧食品（FFPs）作为可持续饲料原料时，其中含有的可可源性甲基黄嘌呤——可可碱（TB）和咖啡因（CF）对动物健康的影响。研究采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）定量分析了12种FFPs中TB和CF的含量，评估了其在动物日粮中的添加比例是否符合欧盟（EU）最大限量（MLs），并通过膳食暴露模型对比毒理学阈值。结果显示，除个别产品外，多数FFPs在30%添加比例下符合欧盟标准，但仔猪在高暴露情景下存在超标风险。文章强调了在FFPs配方设计中需进行物种特异性、生产阶段特异性的评估及甲基黄嘌呤的精准定量，以保障饲料安全并推动循环农业实践。

　　

引言

近年来，全球农业食品系统面临日益增长的压力，需转向更可持续和循环的生产模式，以应对粮食浪费、环境退化和资源短缺问题。作为2030年可持续发展目标的一部分，联合国大会通过了在零售和消费层面将人均粮食浪费减半并减少生产和供应链中粮食损失的目标。在此背景下，旧食品（FFPs）的增值利用成为重要策略。FFPs指原本供人消费但因包装错误、外观缺陷或物流过剩等非安全问题而无法上市销售的食品。尽管退出零售链，FFPs仍保留较高的营养价值，如丰富的淀粉、糖类和脂肪，使其成为有潜力的替代饲料原料。FFPs可包括面包、面条、饼干、零食和糖果等加工食品。这些物料虽技术上安全，但常因视觉或包装缺陷被食品行业丢弃，因为重新包装或再加工的成本超过其商业价值。2018年，欧洲废物法规修订，将非动物源性饲料材料排除在废物范围外，降低了运营商的合规负担，促进了此类材料的再利用，支持循环经济实践。根据欧盟《饲料材料目录》（委员会法规（EU）第68/2013号），旧食品（如烘焙、面食、糕点和糖果行业产品）被明确列为饲料材料。然而，FFPs可能含有原始食品基质中的天然化合物，尤其是含巧克力和可可的糖果，这些是可可碱（TB）和咖啡因（CF）等甲基黄嘌呤的已知来源。这些化合物对动物具有生物活性，可能影响心血管、神经和胃肠系统。甲基黄嘌呤的主要作用机制是抑制腺苷受体，其中TB对腺苷受体的亲和力显著低于CF，但两者对不同腺苷受体亚型的亲和力差异解释了其生理效应的区别。TB具有较强的冠状动脉扩张和心脏刺激作用，而CF对中枢神经系统、呼吸和骨骼肌的刺激作用更强，利尿作用也略强于TB。欧盟动物饲料中若有害物质浓度超过欧洲议会和理事会指令2002/32/EC附件一规定的最大水平（MLs），即被视为不合格。TB被列为这些有害物质之一，其MLs经过调整，目前对一般饲料的限量为300 mg/kg（12%水分），猪饲料为200 mg/kg，狗、兔、马和毛皮动物为50 mg/kg。CF未被列入该指令，但摄入富含CF的咖啡副产品（如咖啡壳和咖啡浆）已显示出不良影响，如家禽体重增长下降、饲料转化率降低和代谢能减少，以及马匹咖啡壳中毒病例。从营养角度看，FFPs虽可变性高，但加工商已建立生产一致性商业产品的方法。FFPs具有高能量密度、丰富的简单碳水化合物和 elevated 脂肪含量，使其在受控条件下适合纳入牲畜日粮。研究表明，FFPs对胃肠道健康、微生物群、生长性能、肉质、生理代谢（如血浆代谢组和肝脏蛋白质组）无不利影响，且对早期泌乳奶牛和泌乳水牛的代谢健康、瘤胃发酵、采食量、体况评分、产奶量和奶质无显著差异。总体而言，FFPs有助于减少食品与饲料竞争，且不损害动物生产力和健康，但其使用需谨慎调控成分和添加率。此外，FFPs的可持续性意义重大，生命周期评估表明，将其用于饲料比替代处置方法（如发电、产热和消化物生产）更能节约水资源和减轻环境负担。从饲料安全角度，FFPs必须符合全面的饲料监管框架，特别是法规（EC）第183/2005号要求所有饲料经营者实施危害分析与关键控制点（HACCP）原则，确保饲料卫生和安全；法规（EC）第178/2002号确立食品法一般原则，包括可追溯性和撤市义务；法规（EC）第767/2009号对饲料上市和使用的要求也完全适用，确保最终用户获得安全、标签准确的产品。监管框架如牛海绵状脑病（BSE）危机后制定的限制，禁止某些废物衍生材料的使用，尤其是含动物副产品的物料，且消费后废物（如食堂或家庭剩菜）被排除在饲料链外。本研究旨在调查12种来自不同欧盟国家FFPs加工商的FFPs中TB和CF的存在，推导目标动物的膳食暴露，并基于甲基黄嘌呤含量对FFPs在动物日粮中的实施提出安全考量，这在指令2002/32/EC确立物种特异性阈值和有害物质最大水平的背景下尤为重要。

材料与方法

化学品：咖啡因和可可碱标准品购自Sigma-Aldrich（Merck，德国）。甲醇、乙醇、HPLC级水、乙腈、丙酮、甲苯、正己烷、乙酸乙酯、分析试剂和酸购自VWR International（法国）。

样品：12个FFP样品在欧盟旧食品加工商自愿活动中收集，以反映市场现状。FFP1、FFP2和FFP3含糖果、烘焙产品和谷物产品；FFP4为膨化米和玉米饼；FFP5包括面食、烘焙品、糖果和糕点；FFP6和FFP10主要为烘焙产品如饼干；FFP7、FFP8和FFP9源自糖果和食品副产品；FFP11含面包、面食和咸味零食；FFP12为含巧克力和饼干的仔猪配方。另设阴性对照（NC，无FFPs的常规断奶仔猪日粮）和阳性对照（PC，可可壳）。所有样品经1 mm筛粉碎后于4°C储存。

化学成分分析：样品分析水分、淀粉、糖、粗蛋白（CP）、乙醚提取物（EE）、中性洗涤纤维（NDF）和灰分，采用AOAC和EC 152/2009标准方法。水分在130°C烘2小时测定；淀粉用偏振法；糖按EC法规；CP用凯氏定氮法；EE用酸水解后索氏提取法；NDF用Ankom 220纤维分析仪（热稳定淀粉酶处理，结果表示为无灰分基础aNDFom）；灰分在550°C马弗炉中燃烧测定。

色谱技术提取方法：每克样品用正己烷脱脂四次，后加80:20甲醇:水溶液过夜提取，离心后过滤，-20°C保存。

高效薄层色谱分析（HPTLC）：用于TB和CF的初步筛查。样品和标准品点样于硅胶板，以水:甲醇:乙酸乙酯（0.7:1.1:8.2, v/v/v）为流动相，254 nm检测。

高效液相色谱分析（HPLC-UV）：定量TB和CF，采用YMC-Triart C18柱，流动相为0.5%甲酸水溶液（A）和0.5%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长280 nm。标准曲线线性R²≥0.99，检测限（LOD）和定量限（LOQ）按信噪比3和10确定。

动物膳食暴露评估（ADE）：基于EFSA默认体重和采食量参数计算。TB或CF在饲料中的浓度（C_feed, DM, mg/kg DM）按公式C_feed, DM = C_sample/ (1 - moisture_FFP/100) × IR/100计算，其中C_sample为FFPs中浓度（μg/g），moisture_FFP为水分（%），IR为添加率（DM基础）。选取30%添加率（基于文献中反刍动物和猪的安全数据），目标动物为反刍动物（奶牛、育肥牛、犊牛、奶羊/奶山羊）和猪（断奶仔猪、育肥猪、泌乳母猪）。评估四种情景（最低、最高、中位数和平均暴露值）。ADE按公式ADE = (C_feed, DM × FI) / bw计算，其中FI为采食量（kg/天 DM），bw为体重。模型ADE值与已公布的未观察到不良效应水平（NOAEL）和最低观察到不良效应水平（LOAEL）比较。

统计分析：HPLC结果进行描述性统计、Pearson相关系数（R²）和Kruskal-Wallis检验，使用IBM SPSS Statistics 29.0.2，图表用GraphPad Prism 10.3.1生成。正态性用Shapiro-Wilk检验，方差齐性用Levene检验，非正态数据用Bonferroni事后检验，显著性设p<0.05。

结果与讨论

化学成分：FFPs的营养成分显示变异性。水分6.2-8.7%。淀粉含量差异大，FFP4（米饼）最高73.4%，FFP12（饼干）最低38.6%。糖含量高，FFP6达27.3%。粗蛋白平均约10%，FFP12和PC较高（约19%）。乙醚提取物4.8-15.4%，表明FFPs比标准谷物饲料脂质丰富。纤维含量异质，粗纤维0.6-5.5%，NDF 5.4-32.1%，FFP8和FFP12最高。灰分1.4-5.5%。这些特征支持FFPs作为“强化版谷物”的分类，适合作为能量密集型饲料原料，但需注意变异性。

可可碱和咖啡因的HPTLC筛查：HPTLC定性显示TB（Rf=0.40）和CF（Rf=0.46）的存在。TB在11个FFPs中检出，未见于FFP4和NC；CF仅在PC中明显。后续用HPLC进行定量分析。

FFPs中可可碱和咖啡因的定量及饲料中浓度：HPLC-UV色谱图显示TB保留时间（Rt）6.8分钟，CF为13.6分钟，NC无峰。定量结果（表2）显示TB浓度59.59±1.46至1147.08±21.95 μg/g，CF 9.28±0.43至118.08±2.39 μg/g，TB/CF比率6.0-12.6，符合可可或巧克力源性产品特征。变异性反映原料中巧克力或可可成分差异。FFP4（米饼）和FFP6（烘焙品）含量低，可能源于交叉污染；FFP8（糖果副产品）最高，表明高可可含量；混合样品（FFP1-3）中等；声明含巧克力的FFP12中等。NC低于检测限。在30%添加率下，除FFP8外，所有FFPs制得的饲料TB浓度低于欧盟MLs。FFP8需将添加率降至26.2%（反刍动物）和17.4%（猪）以符合MLs。

动物膳食暴露评估与安全考量：ADE计算显示，在30%添加率下，猪的暴露最高，尤其是断奶仔猪，反刍动物暴露较低。TB暴露：猪仔0.86-3.61 mg/kg bw/天（最小、中位、平均），反刍动物0.37-2.82 mg/kg bw/天。最大暴露情景（FFP8调整添加率后）中，反刍动物暴露6.44-10.49 mg/kg bw/天，猪6.86-10.00 mg/kg bw/天，因采食量/体重比差异，奶牛和仔猪暴露较高。与毒理学阈值比较：反刍动物暴露低于NOAEL（如奶牛影响产奶的剂量约15 mg/kg bw/天）；猪中，仔猪最大暴露（10.49 mg/kg bw/天）超过EFSA确定的NOAEL（7 mg/kg bw/天），表明其敏感性。总体，多数情景下FFPs使用安全，但需物种特异性评估和TB精准定量。研究支持FFPs作为减少粮食浪费和提升畜牧系统环境效率的可行策略。