妊娠期THC暴露致成年大鼠子代皮质边缘环路生物分子变化的X射线荧光与傅里叶变换红外光谱成像研究

《ACS Chemical Neuroscience》：Adult Rat Offspring Exposed to THC during Gestation Exhibit Distinct Biomolecular Changes Identified by X-ray Fluorescence Imaging and Fourier Transform Infrared Spectroscopy in Cortico-Limbic Circuits

本综述创新性地应用X射线荧光成像（XFI）与傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术，揭示了妊娠期暴露于Δ9-四氢大麻酚（THC）的成年大鼠子代大脑皮质边缘环路存在显著的生物分子改变。研究发现，THC暴露导致胼胝体（CC）周边铜（Cu）浓度降低，并引起海马（Hipp）等脑区的脂质结构（如CH2as）、脂质酯（C=O）、蛋白质（Amide I）、磷酸盐（PO2as）及不饱和脂肪酸（C=C）水平变化，为理解THC对胎儿神经发育的复杂影响提供了新的分子层面证据。

　　

引言

随着一些国家将大麻（Cannabis sativa）合法化，社会对其使用的认知逐渐正常化。尽管有研究指出大麻使用与不良神经发育结局相关，但孕妇使用大麻产品缓解孕期不适（如恶心呕吐）的现象在加拿大和美国日益普遍。大麻中的主要精神活性成分Δ9-四氢大麻酚（THC）是一种内源性大麻素系统（eCS）的部分激动剂，eCS在协调妊娠和神经发育过程中至关重要。由于THC具有亲脂性，它能轻易通过胎盘屏障作用于胎儿大脑。临床前研究表明，妊娠期THC暴露会影响突触发生、神经元细胞骨架结构和髓鞘形成。本研究首次将多模态生物光谱成像技术——X射线荧光成像（XFI）和傅里叶变换中红外光谱显微镜（FTIR）——应用于妊娠期大麻暴露（GCE）动物模型，旨在探究妊娠期暴露于THC的成年大鼠子代大脑中是否存在生物分子变化。

结果与讨论

X射线荧光测量

XFI技术用于研究元素失调情况，重点关注内源性金属，如铜（Cu）、铁（Fe）和锌（Zn）。这是首次在GCE背景下量化子代金属组（metallome）的研究。

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  GCE至THC降低了暴露子代胼胝体中的铜水平：在胼胝体（CC）的周边区域，THC子代的铜浓度显著低于溶剂对照组（VEH）。CC是连接大脑半球的重要白质通路。铜在中枢神经系统（CNS）中扮演关键角色，它调节氧化还原反应，是细胞色素C氧化酶、超氧化物歧化酶等重要金属酶的辅因子，对神经递质合成和髓鞘形成至关重要。铜缺乏与髓鞘形成减少和少突胶质细胞增殖降低有关。THC暴露导致的CC周边铜浓度降低，提示GCE可能影响了铜依赖的神经发育过程，特别是白质区域的发育。
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  GCE至THC未改变暴露子代海马或侧脑室中的铜、锌或铁水平：对海马（Hipp）各个亚区（CA1-CA3、齿状回DG、门区H）以及侧脑室（LV）的分析显示，THC暴露并未引起这些脑区Cu、Zn或Fe浓度的显著变化。海马是学习和记忆形成的关键脑区，侧脑室的脉络丛富含离子转运体，被认为介导金属进入大脑。这些区域元素浓度的稳定，可能反映了Zn和Fe在神经发育和CNS功能中受到严格调控的重要性。

FTIR测量

FTIR成像用于表征生物大分子稳态，提供与XFI互补的信息。通过分析特定波数范围内的吸收峰，可以获取脂质、蛋白质、磷酸盐、碳水化合物等功能基团的信息及其比值，从而揭示生物化学变化。

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  K均值聚类揭示大脑内四个 distinct 簇：对全脑FTIR数据进行无监督K均值聚类分析，将大脑组织客观地分为四个生化组成不同的簇（C1-C4）。这些簇与解剖学脑区高度吻合：C2和C4对应胼胝体、海马伞、视束和内囊等白质丰富的区域，显示出较高的脂质和脂肪酸相关峰表达；C1和C3则对应富含灰质的区域，如大脑皮层深层（C1）和浅层（C3），显示出较高的蛋白质（Amide I）水平。这证实了K均值聚类是一种有效的无偏数据分割工具。
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  FTIR分析显示与CH_2as和碳水化合物相关的峰发生全脑范围变化：与VEH组相比，THC处理显著增加了全脑范围的脂质亚甲基（CH_2as）吸收峰，并降低了碳水化合物吸收峰。同时，脂质结构比值（CH_2as/CH_3as）升高，提示脂质链长可能增加。此外，脂质、胆固醇酯和胆固醇与饱和脂肪酸的相对含量比值（(1360–1480 cm^-1)/2922 cm^-1）在THC组中降低。
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  海马内的K均值聚类揭示两个 distinct 簇：对海马进行聚类分析，得到两个簇：H-C1（蓝色）对应富含轴突和树突arborization的区域（如始层、辐射层、腔隙分子层等），显示出较高的脂质相关峰；H-C2（绿色）对应包含神经元胞体的区域（如锥体细胞层、颗粒细胞层），显示出较高的蛋白质以及脂质、胆固醇酯和胆固醇与饱和脂肪酸的相对含量比值。这与这些细胞层的已知生化组成一致。
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  FTIR分析揭示暴露于妊娠期THC的子代海马中与蛋白质、磷酸盐和脂质相关的峰发生变化：THC暴露导致海马内脂质（CH_2as, CH_3as, 脂质酯C=O, 不饱和脂肪酸C=C）、总脂质、蛋白质（Amide I）和磷酸盐（PO_2as）水平显著增加。不饱和脂肪酸与CH_3as的比值（=C–H/CH_3as）升高，表明脂质不饱和度增加。碳水化合物峰值则在H-C2（神经元胞体层）中特异性降低。这些变化表明THC引起了海马脂质组成的广泛改变、潜在的蛋白质浓度变化以及磷酸盐相关化合物（可能与磷脂或核酸变化有关）的增加。碳水化合物在H-C2的降低可能反映了THC通过线粒体CB1受体（mtCB1R）对脑能量代谢的长期干扰。
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  FTIR分析揭示暴露于妊娠期THC的子代胼胝体脂质峰变化及侧脑室Amide I增加：对CC周边区域的点对点分析显示，THC子代的脂质结构比值（CH_2as/CH_3as）显著增加，这主要是由CH_2as峰面积增加所致，提示脂质结构发生改变。对侧脑室（LV）的分析发现，THC子代的蛋白质（Amide I）峰面积显著高于VEH组，表明脑脊液或周围组织中的蛋白质成分可能发生了改变。侧脑室形态异常常与神经发育精神疾病相关。

妊娠期THC暴露子代中FTIR识别的脂质表达改变

脂质变化在THC暴露子代中尤为突出。海马显示出最广泛的脂质成分改变，包括总脂质、脂质亚甲基/甲基、不饱和脂肪酸和脂质酯的增加。胼胝体周边也观察到脂质结构的变化。THC作为一种亲脂分子，可能通过影响膜流动性或直接干扰脂质代谢途径，改变大脑的脂质环境，这可能与GCE后报道的相关行为改变有关。

结论

本研究首次利用XFI和FTIR成像技术，揭示了妊娠期THC暴露导致成年大鼠子代大脑存在显著的生物分子改变。XFI发现THC暴露与胼胝体铜浓度降低相关。FTIR成像则识别出全脑范围内，特别是在胼胝体和海马，脂质的结构和相对含量发生了THC相关的改变，侧脑室则出现蛋白质增加。这些变化在海马最为明显，表现为脂质CH_2as、脂质酯、PO_2as、Amide I和脂质不饱和度水平的增加。本研究支持了XFI和FTIR技术在检测妊娠期THC暴露引起的脑组织生物分子组成细微变化方面的有效性，为了解THC对胎儿神经发育轨迹的复杂影响增添了新的知识。

方法

实验使用Sprague-Dawley大鼠。妊娠期第6至20天，孕鼠每天接受腹腔注射（i.p.）溶剂（VEH）或3 mg/kg THC。子代于出生后三个月（成年期）处死，取脑左半球进行冠状面切片。XFI数据在加拿大光源（CLS）BioXAS成像光束线收集，入射能量设置为13,450 eV，分析元素包括P、S、Cl、K、Fe、Cu和Zn。FTIR成像数据在CLS中红外光谱显微光束线收集，使用配备焦距平面阵列（FPA）检测器的Agilent Cary 760光谱仪，光谱范围3900–900 cm^-1，分辨率4 cm^-1。数据使用Quasar软件进行预处理和分析，包括大气校正、基线校正和矢量归一化。统计分析采用GraphPad Prism进行，XFI元素浓度比较使用非配对t检验（参数或非参数），FTIR数据根据K均值聚类结果或特定区域点对点选择，采用双因素方差分析（ANOVA）或t检验。