视网膜神经节细胞分化时序依赖性轴突靶向与亚型特化的机制研究

《Frontiers in Neuroscience》：Differentiation timing-dependent axon targeting and subtype specification in retinal ganglion cells

本研究利用Neurod1CreER(D1B)神经发生标记小鼠模型，首次系统揭示了视网膜神经节细胞（RGCs）的分化时序与其轴突投射模式、分子标记表达及树突形态特化的内在关联。通过时序特异性他莫昔芬（TM）诱导，研究发现早期分化（TM11.5）的RGCs优先投射至腹侧外侧膝状体（vLGN）和内侧终核（MTN），而晚期分化（TM15.5）细胞则定向投射至背侧外侧膝状体（dLGN）壳区。该成果为神经系统发育中"时序决定细胞命运"理论提供了重要实验证据。

　　

2 结果

2.1 使用Neurod1^CreER(D1B)驱动小鼠进行神经发生标记

研究团队通过系统比较四种神经发生标记小鼠品系，发现Neurod1^CreER(D1B)品系对视网膜神经节细胞（RGCs）的标记效率最优。该品系与Tau^mGFP-nLacZ报告基因小鼠杂交后，在他莫昔芬（TM）诱导的特定时间窗口（E11.5-E15.5）可实现RGCs的特异性标记。通过EdU掺入实验证实，在E13.5给予TM处理时，标记细胞主要出现在最终DNA合成后6小时，提示Neurod1表达可能始于神经元前体细胞阶段。空间分布分析显示，早期标记（TM11.5）的神经元集中于视网膜中央区，而晚期标记（TM14.5）细胞则呈现更广泛的分布特征。

2.2 神经发生标记RGCs的轴突投射

2.2.1 视束

采用R26-CAG-LF-mTFP1双重组酶报告系统进行眼特异性标记，发现不同时序分化的RGCs轴突在视束中呈现明显的空间分离：TM11.5标记的早期轴突位于对侧视束的深部背侧区，TM15.5标记的晚期轴突则分布于浅层腹侧区，TM13.5轴突居于中间位置。这种 chronotopic 组织模式印证了轴突按分化时序排列的发育规律。

2.2.2 外侧膝状体（LGN）

在丘脑主要视觉靶区LGN中，TM11.5标记轴突同时投射至背侧（dLGN）和腹侧（vLGN）区域，而TM13.5/TM15.5轴突仅靶向dLGN。值得注意的是，TM15.5轴突特异性地富集于dLGN的壳区（shell region）——该区域已知接收方向选择性RGCs的输入。同侧投射仅见于TM13.5和TM15.5群体，定位于dLGN内侧特定区域。

2.2.3 内侧终核（MTN）

属于辅助视觉系统（AOS）的MTN主要接收早期分化（TM11.5）RGCs的投射，晚期分化（TM15.5）细胞则完全缺失此类投射。这一发现提示MTN靶向特性与RGCs的分化时序存在严格关联。

2.2.4 视交叉上核（SCN）

尽管SCN是内在光敏感RGCs（ipRGCs）的关键靶区，但在所有TM时序标记中均未检测到明显投射信号。

2.2.5 上丘（SC）

对中脑视觉整合中心SC的分析显示，TM13.5和TM15.5标记轴突主要分布于对侧SC表层，而TM11.5仅在海马区有少量投射。同侧投射稀疏存在于TM13.5/TM15.5群体，定位于SC表层最深层。

2.3 神经发生标记RGCs的分子标记表达

通过免疫荧光共标记分析，发现泛RGC标记物RBPMS在所有时序群体中均高表达。针对特定亚型的标记显示：SMI-32（α-RGCs）、黑色素视蛋白（ipRGCs）、CART（ON-OFF方向选择性RGCs）和FoxP2（F-RGCs）的阳性细胞比例在时序群体间无显著差异，但CART阳性细胞在TM13.5/TM15.5群体中呈现升高趋势。

2.4 神经发生标记RGCs的形态特征

采用Thy1-STOP-EYFP报告系统进行树突重构，发现TM11.5 RGCs的胞体直径（18.2±3.5μm）显著大于TM15.5细胞（15.9±3.0μm）。树突野直径与胞体大小呈正相关（Spearman相关系数0.55-0.66）。通过VAChT染色标记视网膜内核层（IPL）的ON/OFF亚层，将RGCs分为四型：ON型（树突限于ON亚层）、OFF型（限于OFF亚层）、双分层型（同时分布于ON/OFF亚层）和弥散型（跨亚层分布）。卡方检验显示不同时序群体的树突分层比例存在显著差异（χ²=44.01, p<0.0001），其中TM11.5群体富含ON型细胞（约50%），而TM15.5群体中该类型罕见。

3 讨论

本研究通过神经发生标记技术证实，RGCs的分化时序与其轴突靶向特异性、树突形态和分子特征存在系统关联。TM11.5群体可能包含投射至MTN的ON方向选择性RGCs（如SPIG1/Hoxd10阳性群体）和部分ipRGCs；TM13.5群体涵盖同侧投射RGCs和投射至dLGN核心区的α-RGCs；TM15.5群体则可能以ON-OFF方向选择性RGCs（如DRD4/W9阳性群体）为主。该研究为理解神经系统发育中"时间编码"机制提供了新视角，未来结合单细胞转录组学与功能验证将进一步完善RGC亚型分类体系。

4 材料与方法

实验采用Neurod1^CreER(D1B)转基因小鼠（官方命名：C57BL/6-Tg(Neurod1-cre/ERT2)D1BTahi），通过与多种报告小鼠（Tau^mGFP-nLacZ、Thy1-STOP-YFP、R26-CAG-LF-mTFP1）杂交实现细胞标记。他莫昔芬（9mM）于特定胚胎日（E11.5-E15.5）通过腹腔注射诱导重组。病毒介导的眼特异性标记采用AAV2-CAG-FLPo（4.5×10¹²GC/mL）玻璃体注射。组织学分析采用14-20μm冰冻切片，使用β-半乳糖苷酶、GFP、mTFP1及亚型特异性抗体进行免疫荧光染色。图像采集使用奥林巴斯IX81 FV1000共聚焦显微镜，数据统计通过GraphPad Prism 10完成。