《Frontiers in Immunology》：Human serum influences functional plasticity and transcriptomic landscape of γδ T cells in vitro
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本研究系统评估了无血清培养体系在Vγ9Vδ2 T细胞扩增中的优势，通过单细胞多组学分析揭示其可维持细胞活化表型（高CD69/NKG2D、低PD-1/TIGIT）、增强抗肿瘤细胞毒性及干扰素信号通路活性，为过继细胞疗法（ACT）提供更安全、稳定的标准化生产方案。
1 引言
γδ T细胞因其不依赖主要组织相容性复合体（MHC）的肿瘤识别能力和低移植物抗宿主病（GvHD）风险，成为过继细胞疗法（ACT）的理想候选。尽管含血清培养基长期用于T细胞扩增，但其存在异种污染、批次差异等问题。本研究通过对比含血清与无血清条件下Vγ9Vδ2 T细胞的扩增效率、表型、功能及转录组特征，旨在优化临床级γδ T细胞生产方案。
2 材料与方法
研究采用唑来膦酸（Zoledronate）联合低剂量IL-2/IL-15扩增γδ T细胞，通过流式细胞术评估细胞表型（CD27/CD45RA分群、活化/抑制受体），利用荧光素酶报告系统及实时活细胞成像（Incucyte）分析对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系（MDA-MB-231/468/157）的杀伤活性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）与TCR测序整合分析转录组动态及克隆多样性。
3 结果
3.1 无血清扩增提升细胞纯度与活化表型
无血清条件下γδ T细胞扩增倍数与含血清组无显著差异（526.8倍 vs 462.0倍），但纯度显著提高（86.78% vs 71.65%）。细胞记忆表型（CD27+占比>80%）未受血清影响，而无血清组活化标志物CD69、CD56、HLA-DR、NKG2D表达上调，抑制受体PD-1、TIGIT表达降低。
3.2 细胞毒性不受血清条件制约
无血清扩增的γδ T细胞对TNBC细胞系杀伤活性相当或增强，但CD107a脱颗粒水平在含血清组更高。细胞内颗粒酶B（GzmB）、穿孔素（PFN）荧光强度在无血清组降低，但分泌量增加，提示效应分子释放更高效。
3.3 单细胞转录组揭示分化轨迹一致性
scRNA-seq识别12个细胞簇，显示无血清培养下干扰素刺激基因（ISG）如MX1、STAT1早期高表达，而细胞毒性基因（GZMB、PRF1）在含血清组中后期占优。至培养第14天，两组转录组特征趋同，且TCR克隆多样性均保持稳定。
3.4 细胞因子分泌特征差异
无血清组γδ T细胞在共培养后分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子水平显著提升，尤其是IFN-γ浓度增加2.5倍，可能增强肿瘤微环境（TME）免疫调节作用。
3.5 血清再暴露影响有限
培养末期重新加入血清仅轻微改变脱颗粒与部分细胞因子分泌，对整体杀伤功能无显著干扰，证实无血清扩增产物的体内适应性。
4 讨论
无血清培养体系可产生高纯度、高活化状态的γδ T细胞，其转录组动态虽在中期呈现干扰素信号与细胞毒性程序的差异，但末期趋于一致。TCR多样性保留与功能增强表明该方案具备临床转化潜力。未来需开展体内实验验证其抗肿瘤效力，并探索自动化扩增工艺的可行性。
4.1 研究局限性
样本量较小且仅涵盖健康供体；功能验证限于TNBC模型，缺乏体内数据；未评估大规模封闭系统的扩增稳定性。
