APOE基因型与阿尔茨海默病患者体内天然存在的抗β-淀粉样蛋白抗体的水平有关

《Frontiers in Aging Neuroscience》：APOE genotypes are associated with the level of naturally occurring antibodies to amyloid-β in patients with Alzheimer’s disease

APOEε4基因型与阿尔茨海默病（AD）患者自然抗Aβ抗体水平呈正相关，但调整年龄、性别、血清Aβ水平及MMSE评分后关联性减弱（p=0.050）。该研究首次揭示APOEε4可能通过影响抗体生成或与其他基因连锁不平衡介导AD病理，但需多族裔大样本验证。

　　

载脂蛋白E ε4（APOEε4）等位基因是已知最强的阿尔茨海默病（AD）遗传风险因素。这种关联的机制尚未完全明了。我们的研究旨在确定APOE基因型是否影响体内天然存在的抗β-淀粉样蛋白（Aβ）抗体的水平，而抗Aβ抗体是否会导致神经退行性变，这通过简易精神状态检查（MMSE）得分来衡量。研究对象包括93名意大利AD患者。结果显示，APOEε4携带者的抗Aβ抗体水平显著高于非携带者（p = 0.018）。在调整了年龄、性别、血清中的Aβ水平以及MMSE得分后，回归分析显示APOEε4携带状态与抗Aβ抗体水平之间存在边际关联（p = 0.050）。这是首次此类研究，需要在大型多民族人群中得到验证。

引言

载脂蛋白E（APOE）基因位于19号染色体的q33位置，具有ε2、ε3和ε4三种等位基因。与最常见的APOEe3等位基因相比，APOEε4会增加晚发性阿尔茨海默病（AD）的风险。APOEε4增加AD风险的一个机制是促进β-淀粉样蛋白（Aβ）的聚集和沉积（Jackson等人，2024年）。AD患者会产生抗Aβ自身抗体，这些抗体已被证明可以减少Aβ斑块的负担（Kellner等人，2009年）。个体间天然存在的抗Aβ自身抗体水平存在显著差异，但目前尚未确定可能导致这些差异的宿主遗传因素。识别和理解影响天然抗Aβ免疫反应的宿主因素是成功设计基于Aβ的免疫治疗策略的重要前提。尽管已批准的用于AD治疗的单克隆抗Aβ抗体显示出减缓临床进展的迹象，但它们伴随着严重的副作用，这凸显了进一步了解Aβ免疫生物学的必要性，从而可能开发出更有效的替代疗法（Jucker和Walker，2023年）。

本研究的目的是确定APOE基因型是否影响AD患者体内天然存在的抗Aβ抗体的水平，以及抗Aβ抗体是否会导致神经退行性变，后者通过简易精神状态检查（MMSE）得分来衡量。

材料与方法

患者

共有93名AD患者的DNA和血清样本，这些样本来自意大利米兰IRCCS Fondazione Don Carlo Gnocchi的康复神经科部门。根据NINCDS-ADRDA标准（McKhann等人，2011年），这些患者被诊断为可能的AD患者。如果患者患有营养不良或维生素缺乏综合征，或者最近使用了胆碱酯酶抑制剂、美金刚、抗抑郁药或抗精神病药物，则被排除在外。入选患者的人口统计和临床数据见表1。

表1

表1。入选受试者的 demographic、临床和实验室数据。

APOE基因分型

使用预先设计的TaqMan?探针（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）对三种主要APOE异构体（ε2、ε3和ε4）进行了基因分型——C_904973（rs7412）和C_3084793（rs429358）。

Aβ1-42的测定

根据制造商的说明（产品编号JP27719，IBL International，德国汉堡），使用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）方法测定了所有入选受试者血清中的Aβ1-42水平。具体步骤如下：将100 μL稀释后的血清样本（1:50）加入预包被的微孔中，然后在4°C下孵育过夜。洗涤后，向每个微孔中加入100 μL标记抗体并在4°C下孵育60分钟。再次洗涤后，向每个微孔中加入100 μL显色剂溶液并在室温下孵育30分钟。最后，向每个微孔中加入100 μL终止溶液以停止反应。使用Sunrise（Tecan，瑞士Mannedorf）读数仪读取微孔的吸光度（OD），测量波长为450 nm。Aβ1-42的浓度以pg/mL表示（灵敏度：0.29 pg/mL）。

抗Aβ抗体的测定

也使用ELISA方法测定了AD患者血清中的抗Aβ1-42寡聚体抗体。Aβ抗原购自StressMarq Biosciences（加拿大不列颠哥伦比亚省维多利亚市）。96孔微量滴定板在100 μL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中预先包被了1 μg/mL的Aβ抗原，并在4°C下孵育过夜。随后用含有0.05%吐温20（PBS-T）的PBS洗涤板子，并在37°C下用含有5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS-T封闭1小时。再洗涤后，将适当稀释的患者血浆（1:200）加入微孔中孵育。最后，用HRP结合物在含有3,3′,5,5′-四甲基苯二胺的柠檬酸磷酸盐缓冲液中孵育30分钟作为显色底物。20分钟后加入100 μL 2 N HCl终止反应，并在BioTek ELISA读数仪上测量450 nm处的吸光度值。仅含血浆稀释液的微孔作为空白对照。从样本微孔的吸光度值中减去空白对照的吸光度值，再将结果转换为每微升的任意单位（AU/μL）。

统计分析

统计分析使用了MedCalc统计软件包（版本11.5.0.0；比利时奥斯坦德）和R语言进行。由于样本量相对较小，基因型根据APOEε4的存在与否进行了二值分类。年龄和教育水平呈正态分布，分别以平均值±标准差表示。使用学生t检验比较APOEε4携带者和非携带者的数据。MMSE、Aβ1-42寡聚体和抗Aβ抗体水平不呈正态分布，分别以中位数和四分位数范围（IQR：第25百分位至第75百分位）表示。使用Mann–Whitney检验比较APOEε4携带者和非携带者的MMSE、Aβ1-42寡聚体和抗Aβ抗体水平。使用双侧t检验估计了比较两组之间的统计功效。Fisher精确检验用于比较APOEε4携带者和非携带者的性别差异。应用通用线性回归模型来关联抗Aβ抗体水平与APOEε4携带状态，并调整了年龄、性别、血清Aβ水平和MMSE得分。Spearman相关系数用于确定MMSE得分与抗Aβ抗体水平之间的关联。所有分析中，p < 0.05被视为具有统计学意义。

结果

APOE基因型与抗Aβ抗体水平

研究中纳入的93名AD患者（35名男性和58名女性，平均年龄76.71 ± 6.30岁）的MMSE得分为18.99 ± 3.79（教育水平：8.16 ± 3.36岁）。Aβ1-42寡聚体的中位数为0.01 pg/mL（范围：0.01–1.07 pg/mL）。

在研究的93名AD患者中，有45名（48%）是APOEε4携带者，他们至少携带一个ε4等位基因——无论是杂合状态（ε2/ε4：1；ε3/ε4：38）还是纯合状态（ε4/ε4：6）。其余48名（52%）是非携带者（ε2/ε2：1；ε2/ε3：4；ε3/ε3：43）。这些结果总结在表1中。如图1所示，APOEε4携带者的Aβ1-42寡聚体ELISA反应性显著高于非携带者（14.25 AU/μL；9.82–19.00 AU/μL；Mann–Whitney检验，p = 0.018），统计功效为78%。在调整了年龄、性别、血清中的Aβ水平和MMSE得分后，回归分析显示APOEε4携带状态与抗Aβ抗体水平之间存在边际显著关联（p = 0.050，R2 = 0.15）。这些结果应谨慎解读。

图1

图1。AD患者中APOEε4非携带者与APOEε4携带者的抗Aβ抗体水平比较。

MMSE得分、抗Aβ抗体水平与APOE基因型

MMSE得分与体内天然存在的抗Aβ抗体水平（Spearman相关检验，p = 0.127；95%置信区间：?0.132–0.781；相关系数：0.428）或APOEε4携带状态（Mann–Whitney检验，p = 0.846；APOEε4携带者：MMSE中位数：19；APOEε4非携带者：MMSE中位数：20）无关。这些结果总结在表1中。抗Aβ抗体与Aβ1-42寡聚体之间也没有发现相关性（Spearman相关检验，p = 0.100；95%置信区间：?0.0347–0.374；相关系数：0.177）。

讨论

这里的结果显示APOEε4等位基因的存在与体内天然存在的抗Aβ抗体水平较高之间存在明显关联。至少有两种可能的解释：APOEε4等位基因本身可能影响抗Aβ抗体的产生；或者APOEε4等位基因与19号染色体上另一个尚未鉴定的免疫反应基因之间的连锁不平衡导致了这种关联。

据我们所知，尚无研究报道APOE基因型对体内天然存在的抗Aβ抗体水平的影响。然而，已有研究表明APOEε4等位基因与APOE表达增加有关（Griswold等人，2021年），而APOE表达的增加与接受Aβ1-42免疫的患者中的抗Aβ抗体滴度呈正相关（van Olst等人，2025年）。因此，可以推测APOEε4等位基因可能影响本研究中观察到的天然抗Aβ抗体的水平——假设产生天然抗Aβ抗体的免疫机制与接种Aβ后产生的抗Aβ抗体的免疫机制相似。

乍一看，这些结果似乎违反直觉。由于APOEε4是已知的最强阿尔茨海默病遗传风险因素，而天然存在的抗Aβ抗体可以减少Aβ斑块负担（Kellner等人，2009年），人们可能会预期APOEε4携带者的抗体水平应低于非携带者。另一方面，APOEε4促进的Aβ聚集和沉积（Jackson等人，2024年）会增加Aβ抗原负荷，从而导致更高的抗Aβ抗体水平。

本研究存在一些局限性。该研究采用横断面设计，仅测量了APOE基因型与抗Aβ抗体之间的关联，但无法证明因果关系。由于我们没有PET或脑脊液数据，因此不能排除较高的抗体水平反映了大脑中较高的Aβ抗原负荷。抗Aβ IgG水平没有标准化为总IgG水平。因此，APOEε4组中较高的抗Aβ IgG水平可能反映了ε4等位基因与较高总IgG水平之间的潜在关联。

这是首次报道APOE基因型参与对Aβ的体液免疫的研究。由于APOEε4相关的AD风险存在显著的种族/民族差异（Jackson等人，2024年），需要一项涉及大型多民族人群的研究来明确APOEε4决定因素在天然抗Aβ抗体生成中的作用。