哈茨木霉CP 24–6生物杀菌剂不同剂量与施药时机对可可霜霉病的防控效果研究

《Frontiers in Plant Science》：Efficacy of a biofungicide based on Trichoderma afroharzianum CP 24–6 against cacao frosty pod rot under different doses and application timings

本文评价了哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）CP 24–6菌株生物杀菌剂在不同剂量（1×105与1×106conidia/mL）与可可果实不同发育阶段（20、40、60天）施用后，对霜霉病（Moniliophthora roreri）人工感染的防控效果。结果表明，高剂量（1×106conidia/mL）在果实发育后期（60天）施用效果最佳，可显著延缓症状出现、降低内外病害严重度，为可可霜霉病的可持续治理提供有效生物防治策略。

　　

引言

可可（Theobroma cacao L.）作为起源于南美上亚马逊地区的重要经济作物，其豆粒是全球巧克力产业的主要原料，维系着数百万小农户的生计。然而，可可生产面临诸多限制，其中由霜霉病（Moniliophthora roreri）引起的真菌病害尤为突出。该病专性侵染可可果实，导致果实畸形、早熟、产生褐色病斑并覆盖粉状孢子，造成高达80%的产量损失。自1989年在秘鲁亚马逊地区首次报道以来，霜霉病已成为当地可可种植的主要植保挑战。化学杀菌剂虽能一定程度控制病害，但存在环境与健康风险，且不符合有机认证标准。因此，生物防治作为一种可持续替代方案日益受到重视。木霉属（Trichoderma）真菌因其拮抗活性（如重寄生、竞争和抗生作用）被广泛应用于多种作物的病害防控。本研究旨在评估本地分离的哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）CP 24–6菌株所制生物杀菌剂，在不同剂量与施药时机下对可可霜霉病的防控潜力。

材料与方法

研究始于亚马逊国立大学植物健康实验室。首先，以预煮米饭为基质，通过固体发酵大量生产哈茨木霉CP 24–6的分生孢子。菌株在PDA培养基上28°C培养6天后，菌丝体转移至含氯霉素的无菌水中，接种至灭菌米饭，28°C暗培养3天后转为光暗交替（12小时/12小时）直至第9天，确保基质均匀 colonized。通过洗涤与沉淀回收孢子，40°C烘干21小时获得脱水孢子。生物杀菌剂配方为25%脱水孢子（活性成分）与75%玉米淀粉（惰性材料）混合，加水悬浮后4°C沉淀48小时，再40°C烘干13小时，研磨后密封冷藏备用。

质量控管包括孢子计数（Neubauer血球计）、菌落形成单位（CFU）定量、纯度检测、孢子萌发率、pH值及含水量测定。结果显示，制剂孢子剂量为1.1×10¹⁰conidia/g，CFU为3.1×10⁹/g，纯度100%，萌发率96.02%，pH 5.8，含水量4.5%。

田间致病性试验在秘鲁亚马逊地区Cajaruro区的10年生Indes 31可可种植园进行。采用完全随机区组设计，双因子（孢子剂量：1×10⁵与1×10⁶conidia/mL；感染时果实日龄：20、40、60天）交互产生6个处理（T1–T6），各5重复，并设同龄感染对照（C20、C40、C60）。开花后自然授粉果实被隔离，在指定日龄局部喷施生物杀菌剂（剂量依果实大小调整：20天1 mL、40天2 mL、60天3 mL），每20天施用一次。施药后人工接种M. roreri孢子悬浮液（1×10⁵conidia/mL）。病害评估包括：每20天记录外部严重度（ES，0–5级），计算病害进展曲线下面积（AUDPC）；采收时评估内部严重度（IS，坏死组织百分比）；发病率（感染果实/总果实×100）；基于IS计算生物防治效价（Abbott公式）。数据经Shapiro-Wilk与Bartlett检验后，进行ANOVA与Tukey多重比较（p≤0.05）。

结果

质量分析显示，哈茨木霉CP 24–6在米饭基质上培养9天后均匀 colonized，制剂质量参数符合应用标准。田间试验中，未施药对照组在感染早期（20、40天）约20天后出现黄化与畸形症状，而60天感染组症状延迟至40天后显现，表现为褐色斑点逐渐扩大。AUDPC分析表明，1×10⁶conidia/mL剂量在所有感染年龄均显著降低病害进展（p<0.05）。ES与IS呈强正相关（r=0.98）。高剂量（1×10⁶conidia/mL）施用于40天（T5）与60天（T6）感染果实，以及低剂量（1×10⁵conidia/mL）施用于60天感染果实（T3）时，ES与IS值最低（ES: 0.92–1.14；IS: 1.22–1.48，对应24%–29.6%内部坏死），表现为轻微褐斑与渗出；而对照组与20天感染低剂量处理（T1）严重度最高（ES: 4.04–5；IS: 4.6–5，对应92%–100%坏死），果实完全木乃伊化并大量产孢。发病率无显著组间差异（p>0.05）。生物防治效价以T5（72.1%）、T6（72.5%）与T3（66.7%）最高，显著优于其他处理。

讨论

本研究通过预防性施用本地哈茨木霉菌株CP 24–6，证实其对可可霜霉病具有显著防控效果。M. roreri侵染过程包括孢子萌发直接穿透或经气孔侵入，经历长达60天的生物营养期（无症状）后转为坏死营养期，产生典型病征。早期感染果实症状出现早、病害进展快，与Bailey等（2013）及Phillips Mora（1986）报道一致。生物杀菌剂应用显著降低AUDPC，尤以高剂量（1×10⁶conidia/mL）效果突出，印证了拮抗微生物预先定植的重要性（Ferreira and Musumeci, 2021）。人工感染与高湿环境导致发病率普遍偏高（90%–100%），与Villamil-Carvajal等（2015）结果类似，但严重度指标更能反映防控效果。ES与IS的高度相关性说明外部病征可有效指示内部损伤。果实年龄与孢子浓度的交互作用显著：后期感染（60天）与高剂量组合防控效果最佳，可能与果实成熟度提高、病原菌侵染力下降及拮抗菌定植优势有关。本地菌株CP 24–6的适应性强化其田间持久性，此结果支持Leiva-Espinoza（2022）关于土著菌株应用潜力的结论。内部严重度作为效价评估核心参数，更准确反映病害对商品价值的损害（Phillips-Mora et al., 2005）。

结论

哈茨木霉CP 24–6生物杀菌剂的防控效价受剂量与感染年龄交互作用显著影响。高剂量（1×10⁶conidia/mL）在果实发育后期（60天）施用可延迟症状出现、降低内外严重度，效价达72.5%；而低剂量（1×10⁵conidia/mL）在早期（20天）效果较差。未施药对照组无论感染早晚均表现高敏感性。本研究为可可霜霉病的可持续治理提供了基于本地微生物资源的有效生物防治方案。