《Frontiers in Stroke》：CXCL1: a novel therapeutic target to increase aneurysm healing after coil embolization
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本研究发现CXCL1（C-X-C motif chemokine ligand 1）中和抗体能显著改善小鼠动脉瘤模型弹簧圈栓塞后的愈合效果。通过14-21天的系统性CXCL1中和治疗，可减少中性粒细胞浸润，促进巨噬细胞向修复型M2表型极化，从而增加瘤腔内组织生长（tissue ingrowth）。该研究为改善动脉瘤栓塞术后复发问题提供了新的治疗靶点。
引言
颅内动脉瘤（IA）破裂会导致蛛网膜下腔出血，这是一种致死率极高的危重病症。对于经过严格筛选的患者，弹簧圈栓塞术仍然是治疗未破裂颅内动脉瘤的常用血管内技术。然而，该技术存在一个明显缺陷：高达26.3%的栓塞动脉瘤会出现再通现象，可能需要进行再次治疗。因此，开发能够实现动脉瘤完全闭塞的持久性技术至关重要。既往尝试改良动脉瘤弹簧圈的材料对复发率的影响结果不一。另一种策略是通过药物增强弹簧圈栓塞后的动脉瘤愈合过程。然而，开发药物治疗方案需要揭示参与动脉瘤愈合的新机制。
根据组织病理学研究，弹簧圈栓塞后的愈合过程与伤口愈合相似。动脉瘤栓塞后，弹簧圈之间的空隙会被血栓填充。在实现完全闭塞的动脉瘤中，这一过程之后会伴随炎症细胞浸润、结缔组织增殖和纤维瘢痕形成。重要的是，炎症过程的消退是过渡到形成稳定瘢痕的关键步骤。动脉瘤愈合特有的炎症通路尚未被完全阐明。已有研究表明，在颅内动脉瘤中促炎趋化因子CXCL1（一种强效的中性粒细胞趋化因子）的表达增加。持续的中性粒细胞活化和未解决的炎症与非愈合伤口有关。此外，在小鼠颅内动脉瘤模型中，CXCL1中和促进了巨噬细胞从"促炎"的M1表型向"修复"的M2表型转换。事实上，M2巨噬细胞与改善的伤口愈合相关。
鉴于（1）CXCL1在颅内动脉瘤中的表达增加，以及（2）CXCL1在调节参与伤口愈合的关键白细胞中的作用，研究人员提出假设：CXCL1中和将改善弹簧圈植入后的动脉瘤愈合。同时，研究人员还研究了中性粒细胞浸润和巨噬细胞表型的变化，以阐明CXCL1介导的动脉瘤愈合机制。
材料与方法
本研究使用雌性和雄性C57BL/6小鼠（8-12周龄）进行所有实验。动物研究获得了机构动物护理和使用委员会的批准。总共使用了75只雌性小鼠和75只雄性小鼠，其中8只雌鼠和10只雄鼠因动脉瘤形成不充分而被排除。
首先，通过免疫组化比较了动脉瘤小鼠与假手术小鼠颈动脉中的CXCL1表达。动脉瘤模型通过弹性蛋白酶手术创建。21天后，处死小鼠并采集右颈总动脉（RCCA）进行切片和CXCL1表达定量（使用相对荧光单位RFU）。
在另一个队列中，动脉瘤使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）涂层铂金弹簧圈进行栓塞。小鼠被随机分配接受CXCL1中和抗体或同型IgG对照的腹腔注射。注射在栓塞前2天开始，每2天一次，直至实验终点（栓塞后7、14或21天）。这些小鼠在栓塞后21天被处死，采集栓塞的动脉瘤进行评估。
通过组织学测量瘤腔内组织生长百分比。计算公式为：生长（%）= （外面积 - 内面积）/ 外面积 x 100。每个动物随机选择三个切片进行测量取平均值。
通过免疫组化评估CXCL1表达以及中性粒细胞（NIMP-R14标记）、巨噬细胞（F4/80标记）、M1巨噬细胞（F4/80和iNOS共标记）和M2巨噬细胞（F4/80和精氨酸酶1共标记）的浸润。计数在高倍视野（hpf）下进行。
实验实施盲法和随机化。使用Mann-Whitney U检验比较组间差异，使用单因素方差分析（ANOVA）及Newman-Keuls事后检验比较同一实验组内不同治疗时长的影响。显著性阈值设定为p < 0.05。
结果
CXCL1在鼠颈动脉瘤中的表达增加
免疫组化证实，与假手术小鼠的正常颈动脉相比，雌性和雄性小鼠的颈动脉瘤中CXCL1表达均显著升高（雌性：26.8 ± 3.22 vs. 10.6 ± 2.31 RFU, n = 4 each, p = 0.03；雄性：32.3 ± 4.42 vs. 8.1 ± 2.55 RFU, n = 4 each, p = 0.03）。雌雄小鼠动脉瘤之间的CXCL1表达无显著差异（26.8 ± 3.22 vs. 32.3 ± 4.42 RFU, n = 4 each, p = 0.49）。
CXCL1中和14天和21天可增加栓塞动脉瘤的组织生长
在雌性小鼠中，与IgG对照组相比，CXCL1中和治疗14天（66.4% ± 2.60 vs. 51.2% ± 5.01; n = 5 each; p = 0.03）和21天（71.9% ± 5.79 vs. 44.3% ± 5.10; n = 7 and 8; p = 0.002）能显著增加组织生长，但治疗7天无效（48.1% ± 5.71 vs. 49.4% ± 7.03; n = 9 and 7; p = 0.92）。
在雄性小鼠中，也观察到类似结果：CXCL1中和治疗14天（69.8% ± 5.13 vs. 47.0% ± 5.29; n = 6 each; p = 0.004）和21天（67.8% ± 3.93 vs. 53.8% ± 4.25; n = 7 and 8; p = 0.02）能显著增加组织生长，治疗7天无效（52.3% ± 3.68 vs. 50.4% ± 6.33; n = 5 each; p = 1.00）。
CXCL1中和对中性粒细胞浸润的影响
在栓塞后14天，CXCL1中和显著减少了雌性（0.43 ± 0.28 vs. 5.21 ± 2.40 cells/hpf, n = 7 and 8, p = 0.04）和雄性（0.00 ± 0.00 vs. 4.42 ± 2.41 cells/hpf, n = 5 and 4, p = 0.04）动脉瘤中的中性粒细胞浸润。
在栓塞后21天，同样观察到中性粒细胞显著减少（雌性：0.79 ± 0.43 vs. 5.96 ± 2.28 cells/hpf; n = 7 and 4, p = 0.03；雄性：0.38 ± 0.38 vs. 4.27 ± 1.54 cells/hpf, n = 7 and 8, p = 0.03）。
然而，在栓塞后7天，CXCL1中和对中性粒细胞浸润没有显著影响（雌性：5.50 ± 1.31 vs. 6.56 ± 1.79 cells/hpf, n = 4 and 3, p = 0.72；雄性：6.25 ± 1.92 vs. 8.89 ± 4.45 cells/hpf, n = 4 and 3, p = 0.63）。
CXCL1中和对巨噬细胞极化和浸润的影响
M1巨噬细胞：在栓塞后7天和14天，CXCL1中和对雌雄小鼠的M1巨噬细胞数量均无显著影响。在栓塞后21天，CXCL1中和显著减少了雄性小鼠的M1巨噬细胞（0.73 ± 0.28 vs. 2.03 ± 0.45 cells/hpf, n = 5 each, p = 0.045），但对雌性小鼠无显著影响（1.21 ± 0.43 vs. 2.53 ± 0.50 cells/hpf, n = 7 and 4, p = 0.22）。
M2巨噬细胞：在栓塞后14天，CXCL1中和显著增加了雌性（2.25 ± 0.39 vs. 0.79 ± 0.31 cells/hpf, n = 4 each, p = 0.03）和雄性（2.00 ± 0.38 vs. 0.27 ± 0.12 cells/hpf, n = 5 each, p = 0.02）小鼠的M2巨噬细胞数量。在栓塞后7天和21天，则无显著影响。
总巨噬细胞负荷：在栓塞后7、14或21天，CXCL1中和对雌雄小鼠的总巨噬细胞浸润均无显著影响。
讨论
动脉瘤复发是弹簧圈栓塞术的一个显著缺点，需要寻找新的策略以实现持久的治疗效果。其中之一可能包括使用药物增强栓塞后的愈合过程。然而，开发此类策略需要更好地理解弹簧圈栓塞后动脉瘤愈合的潜在机制。使用人类尸检标本和动物模型的研究均支持弹簧圈栓塞后炎症的关键作用，并提示瘤腔内愈合可能与伤口愈合有相似之处。中性粒细胞是炎症或损伤部位的第一反应者，通过趋化因子被招募。我们先前已经确定了中性粒细胞在颅内动脉瘤病理生理学中的关键作用。当它们聚集并通过促炎信号激活后，会根据提供的刺激招募巨噬细胞。
本研究证实了CXCL1在雌雄小鼠颈动脉瘤中的表达均增加。通过在先前建立的模型中向颈动脉瘤植入PLGA涂层弹簧圈，并系统性给予CXCL1中和抗体，发现持续14天和21天的CXCL1中和能改善雌雄小鼠的组织生长。为了解其机制，研究人员分析了关键炎症细胞群的变化。CXCL1是一种强效的中性粒细胞趋化剂，中性粒细胞可能通过造成间接组织损伤而对组织愈合过程产生不利影响。确实，CXCL1中和在栓塞后14天和21天减少了雌雄小鼠的中性粒细胞浸润。
在颅内动脉瘤模型中，先前研究表明CXCL1影响巨噬细胞在"促炎"M1和"修复"M2表型之间的转换。在慢性不愈合伤口中，巨噬细胞主要是M1表型。相反，M2巨噬细胞有助于组织修复和瘢痕形成。瘢痕形成是栓塞动脉瘤的理想结果以防止复发。本研究发现，接受CXCL1中和治疗的雌雄小鼠在栓塞后14天M2巨噬细胞增加，但在7天或21天时无此效应。CXCL1中和仅在栓塞后21天减少了雄性小鼠的M1巨噬细胞。这些发现表明，在动脉瘤愈合的中间阶段"修复性"M2巨噬细胞的增加可能是14天CXCL1中和治疗带来组织生长增加的原因。值得注意的是，总巨噬细胞浸润不受CXCL1中和的影响。
总之，CXCL1中和治疗14天和21天可改善雌雄小鼠的动脉瘤愈合。相应地，CXCL1中和在栓塞后14天减少了中性粒细胞浸润，并将巨噬细胞表型向"修复性"M2表型转变。这种相关性提示CXCL1中和起效的机制是通过在栓塞后14天调节中性粒细胞趋化和巨噬细胞极化。因此，CXCL1是改善瘤腔内动脉瘤愈合的一个新的治疗靶点。鉴于栓塞模型的转化适用性，靶向CXCL1通路是改善栓塞术后结局和预防动脉瘤复发的可行选择。本研究结果具有直接的临床应用前景，例如可以对接受栓塞术的患者使用CXCL1抑制剂（如口服药物）来提高动脉瘤治愈的机会。此外，由于研究同时使用了雌性和雄性小鼠，考虑了性别差异，结果可能具有广泛的临床适用性。
局限性与未来方向
本研究存在一些局限性。首先，栓塞模型使用的是颅外血管，但该模型的目的是研究瘤腔内组织愈合。其次，CXCL1阻断剂与IgG对照的给药方案在动脉瘤栓塞前2天开始。结果表明，中性粒细胞数量持续升高，M2巨噬细胞稀少，直到CXCL1阻断14天后才发生改变。从临床转化角度看，需要未来研究确定是否需要在动脉瘤治疗开始时即持续进行CXCL1阻断，或者治疗是否可以在炎症级联反应的后期（例如，动脉瘤治疗后3-5天）开始。
此外，虽然研究了CXCL1中和对中性粒细胞浸润和巨噬细胞表型的影响，但需要进一步研究来直接探究各自的相关贡献。未来直接清除中性粒细胞和M2巨噬细胞的研究将提供更明确的因果证据。另外，先前研究过局部调节炎症通路的效果。未来针对通过药物洗脱弹簧圈进行局部CXCL1阻断的研究将具有重要的转化价值。同时，越来越多的证据表明颅内动脉瘤的病理生理学在雌雄性别间存在差异。虽然本研究目的并非直接比较雌雄性别差异，但该领域的未来研究将具有重要的临床意义。
