埃博拉疫苗诱导免疫中长链非编码RNA的动态调控与抗体应答机制研究

《Frontiers in Immunology》：Long non-coding RNAs in response to Ebola virus vaccine-induced immunity

本文通过分析三个独立临床试验队列的RNA测序数据，首次系统揭示埃博拉疫苗rVSVΔG-ZEBOV-GP接种后长链非编码RNA（lncRNA）的动态表达谱。研究发现DOCK8-AS1、LEF1-AS1等11个核心lncRNA在接种后第1天呈现保守表达模式，并通过相关性分析证实其与干扰素信号通路、T细胞分化等免疫过程密切相关。特别值得注意的是，FAM225A与早期IgG滴度呈正相关，而LEF1-AS1/DOCK8-AS1可能通过启动子反义RNA（PAS-RNA）机制调控相邻免疫基因，为疫苗应答个体差异提供了新的非编码RNA调控视角。

埃博拉疫苗诱导免疫中长链非编码RNA的调控机制

引言

埃博拉病毒病（EVD）是由扎伊尔型埃博拉病毒（Orthoebolavirus zairense）引起的烈性出血热，死亡率高达50%-90%。2014-2016年西非疫情导致超过1.1万人死亡，而2018-2020年刚果民主共和国的疫情造成3,323例感染和2,299例死亡。为应对疫情，美国FDA先后批准了单克隆抗体组合药物Inmazeb^?和Ebanga^?，并开发出有效疫苗rVSVΔG-ZEBOV-GP（商品名ERVEBO^?）。该疫苗采用重组水疱性口炎病毒（VSV）载体表达埃博拉病毒糖蛋白（GP），在几内亚疫情期间显示84%的保护效果。此外，双针异源方案Ad26.ZEBOV/MVA-BN-Filo（Zabdeno^?/Mvabea^?）也在成人和儿童中显示出良好免疫原性。

系统疫苗学（Systems vaccinology）研究通过高通量技术分析疫苗接种前后基因表达与抗体持久性的关联，为疫苗设计提供指导。VSV-EBOVAC和VSV EBOPLUS联盟通过转录组学发现，rVSVΔG-ZEBOV-GP接种后第1天出现基因表达峰值，包括I/II型干扰素应答基因上调和细胞毒性基因下调。然而这些研究主要聚焦蛋白编码基因，对非编码RNA的关注不足。

长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200核苷酸的非编码调控RNA，可通过RNA-RNA、RNA-DNA和RNA-蛋白相互作用精细调控基因表达。研究表明lncRNA参与免疫调节过程，如细胞因子产生（如THRIL调控TNFα表达）、髓系细胞活化以及T/B细胞分化。在病毒感染中，BISPR作为干扰素刺激基因（ISG）在HCV感染中上调，而EGOT可抑制干扰素应答促进病毒复制。但lncRNA在埃博拉疫苗免疫应答中的作用尚未明确。

结果

rVSV-ZEBOV疫苗接种诱导跨队列保守的lncRNA表达

研究整合了三个独立临床试验队列：VSV EBOVAC（日内瓦，n=98）、VSV EBOPLUS（美国，n=33）和VEBCON（德国，n=18）。所有志愿者在接种第0天接受单剂疫苗，并在第0、1、2、3、7天采集血液进行RNA测序，同时在两年内多次采集样本用于IgG滴度ELISA检测。

结果显示所有队列中基因表达扰动峰值均出现在接种后第1天。通过差异表达分析和荟萃分析，鉴定出11个在三个队列中保守差异表达的lncRNA，其中9个上调（SERPINB9P1、FAM225A、FOXN3-AS1、LINC00487、DLEU2、C8orf31、CYTOR、DOCK8-AS1和LINC00189），2个下调（LEF1-AS1和ATP6V0E2-AS1）。LINC00487和FAM225A上调最显著，LEF1-AS1下调最明显。多数lncRNA在第2-7天恢复基线水平，仅LINC00487持续高表达至第7天。

疫苗诱导lncRNA与免疫通路基因表达相关

通过相关性荟萃分析发现，DOCK8-AS1（1123个相关mRNA）、LEF1-AS1（1243个）和FAM225A（1284个）具有最多相关mRNA。功能富集分析显示：

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  FAM225A和DOCK8-AS1正相关基因富集于干扰素应答和单核细胞通路，负相关基因富集于T细胞相关基因
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  LEF1-AS1呈现相反模式，负相关基因富集于干扰素信号，正相关基因富集于T细胞表达

具体而言，FAM225A与干扰素通路关键基因IRF7、病毒传感器MDA5编码基因IFIH1、巨噬细胞必需基因USP18强正相关；DOCK8-AS1与IFIH1及干扰素刺激基因P2RY13正相关；两者均与T细胞受体信号基因ZAP70负相关。LEF1-AS1与白细胞表达基因FCN1和IgE受体基因FCER1G强负相关。

lncRNA表达与IgG滴度时序相关性

通过lncRNA表达与抗体滴度的荟萃分析发现：

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  FAM225A第1天表达与第14、56天IgG滴度正相关
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  DOCK8-AS1第1天表达与第28、84、168、365天IgG滴度负相关
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  LEF1-AS1第1天表达与第360天（1年）IgG滴度负相关
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  CYTOR与第28、168天抗体水平负相关，C8orf31与第14、56天滴度正相关

DOCK8-AS1可能作为DOCK8的启动子反义RNA

DOCK8-AS1与DOCK8在所有队列和时间点均呈现强正相关，甚至在接种前即存在基础相关性。通过分析仙台病毒感染的淋巴母细胞全局核 run-on测序（GRO-seq）数据，发现DOCK8-AS1（反义链）和DOCK8（正义链）在病毒感染24小时后出现共表达峰值。在DOCK8基因内部的替代启动子区还检测到另一反义lncRNA ENSG00000235880的转录活性，提示这两个lncRNA可能作为启动子反义RNA（PAS-RNA）通过双向启动子调控DOCK8表达。DOCK8蛋白对T滤泡辅助细胞（T_fh）在生发中心的定位至关重要，其突变会导致高IgE综合征和抗体生成缺陷。

LEF1-AS1调控LEF1表达且具有疫苗特异性

LEF1-AS1是淋巴细胞发育关键因子LEF1的反义lncRNA。疫苗接种后第1天两者同步下调，第2-4天恢复基线，表达高度正相关。基因组分析显示LEF1-AS1转录起始区存在H3K27Ac组蛋白修饰标记，提示其可能作为PAS-RNA调控LEF1表达。与流感疫苗（GSE186006、GSE196793）和登革热疫苗（GSE146658）数据对比发现，LEF1-AS1/LEF1下调模式为埃博拉疫苗特有，可能反映rVSV载体疫苗特有的免疫调节机制。

讨论

rVSVΔG-ZEBOV-GP作为复制型病毒载体疫苗，可诱导强烈的I型干扰素（IFN-I）签名和髓系细胞活化。本研究首次揭示lncRNA在此过程中的核心调控作用：11个保守差异表达的lncRNA构成"非编码免疫设定点"，通过不同机制协调先天免疫与抗体应答。

其中FAM225A可能通过反式作用强化干扰素信号和抗原呈递，促进T_fh细胞和生发中心B细胞活化，其与早期IgG正相关支持这一假设。DOCK8-AS1可能作为PAS-RNA顺式调控DOCK8表达，影响T_fh细胞迁移和GC形成，其与远期IgG负相关提示早期过度活化可能不利于长效体液免疫。LEF1-AS1/LEF1下调可能暂时解除发育检查点，允许抗原驱动B细胞活化，其与1年抗体负相关表明个体差异可能影响GC输出效率。

除上述核心lncRNA外，其他成员如CYTOR与黑色素瘤免疫治疗反应、HIV感染调控相关；DLEU2编码肽段可诱导调节性T细胞；FOXN3-AS1参与肿瘤免疫浸润调控，共同构成复杂的免疫调节网络。

方法

研究纳入三个临床试验队列的RNA-seq数据（VSV-EBOVAC使用IonTorrent测序，VEBCON使用Illumina HiSeq 2500），通过edgeR进行差异表达分析（FDR<0.05，|log2FC|>0.26）。采用随机效应模型进行lncRNA-mRNA和lncRNA-IgG相关性荟萃分析。功能富集使用Reactome通路和血液转录模块（BTM）数据库。GRO-seq数据通过BWA比对至GRCh38基因组。IgG检测采用FANG标准ELISA方法。

本研究首次系统阐明lncRNA在埃博拉疫苗免疫应答中的调控网络，为疫苗应答个体差异机制提供了新见解，也为靶向非编码RNA的疫苗增效策略奠定基础。