《Frontiers in Immunology》：Chicken IRF10 suppresses the cGAS-STING-IFN antiviral signaling pathway by targeting IRF7
引言
先天免疫系统是宿主抵御病原体入侵的第一道防线，通过模式识别受体（PRRs）网络来识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）。这一识别过程触发信号级联反应，最终导致I型干扰素（IFNs）、细胞因子和趋化因子的产生，从而启动初始抗病毒反应。
环状GMP-AMP合成酶（cGAS）是一种关键的胞质DNA传感器，其在结合双链DNA（dsDNA）后，催化合成2‘3’-cGAMP。cGAS检测胞质中的病毒dsDNA以及来源于细胞核或线粒体的异常DNA。第二信使2‘3’-cGAMP激活内质网适配蛋白干扰素基因刺激因子（STING），导致TBK1激酶和转录因子IRF3的招募和磷酸化。磷酸化的IRF3形成二聚体，转运至细胞核，并启动I型干扰素的转录。STING也能激活NF-κB以增强炎症反应。值得注意的是，鸡缺乏IRF3，而是依赖IRF7来介导STING驱动的IFN产生。
IRF转录因子家族在免疫调控、抗病毒防御和细胞分化中扮演关键角色。虽然哺乳动物有九个IRF成员，但鸡编码了一个独特的组合，其中包括IRF10，但缺乏IRF3和IRF9。所有IRF成员在其N端包含一个高度保守的DNA结合域（DBD），除IRF6外，所有成员在其C端包含一个相对保守的IRF关联域（IAD）。DBD使IRF能够结合特定的干扰素刺激反应元件（ISRE）启动子序列，而IAD用于IRF之间或与其他转录因子形成同源或异源二聚体，促进转录激活或调控。
鸡IRF家族成员与其哺乳动物同源物高度保守，但也存在物种特异性差异。尽管鸡干扰素调节因子7（chIRF7）被确定为哺乳动物IRF3的功能类似物，但其他鸡IRF，特别是鸡中存在而哺乳动物中缺失的chIRF10，在先天免疫cGAS-STING信号通路中的作用仍不清楚。先前的研究表明，chIRF10参与两个主要IFN-γ靶基因的上调，但干扰I型IFN靶基因的诱导，并作为宿主抗病毒反应的负调节因子。
本研究系统评估了鸡IRF家族成员在cGAS-STING-IFN通路中的参与情况。研究证实chIRF7是STING诱导的IFN转录的主要介导者，并鉴定出chIRF10是一个有效的负调控因子。进一步的研究揭示，chIRF10通过其IAD结构域与chIRF7相互作用，抑制IRF7的二聚化和激活。这些结果揭示了一种新的调控鸡抗病毒信号通路的机制，并突显了chIRF10作为先天免疫的关键调节因子。
材料与方法
研究使用了多种抗体和试剂，包括FLAG、HA、GAPDH、GFP、Myc和RFP等标签抗体，以及相应的二抗。细胞培养使用了HEK-293T细胞、鸡成纤维细胞DF-1细胞和鸡巨噬细胞HD11细胞。病毒包括新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV, H1N1）和痘病毒（VACV和SMV株）。通过分子克隆技术构建了鸡IRF家族成员、TBK1和IKKε的表达载体，并利用定点突变技术构建了chIRF10的缺失突变体（ΔDBD和ΔIAD）。功能分析采用了荧光素酶报告基因试验、实时定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-IP）、天然PAGE分析chIRF7二聚化、共聚焦显微镜观察亚细胞定位以及利用CRISPR/Cas9技术生成chIRF10基因敲除的HD11细胞系。数据统计分析采用Student‘s t检验或方差分析（ANOVA）。
结果
筛选鸡IRF家族成员在cGAS-STING-IFN信号通路中的作用
先前研究包括本团队的工作表明，鸡天然缺乏IRF3，而是利用IRF7作为STING下游激活I型IFN转录的关键转录因子。然而，鸡IRF家族包含多个成员，其他IRF是否参与或调控鸡cGAS-STING-IFN抗病毒信号通路尚不清楚。为探究此问题，研究构建了八个chIRF家族成员（IRF1, IRF2, IRF4, IRF5, IRF6, IRF7, IRF8, IRF10）的表达载体。由于293T细胞缺乏基础的IRF7表达，且鸡cGAS-STING无法在该细胞系中激活IFN信号，研究首先在293T细胞中进行实验发现，在所有鸡IRF中，只有IRF7与鸡cGAS-STING协同激活ISRE启动子。其次，在具有基础IRF7表达的鸡成纤维细胞系DF-1中，chIRF7增强了chSTING激活的IFN-β启动子活性，证实了chIRF7作为介导chSTING激活IFN诱导的转录因子的作用。此外，研究发现chIRF10显著抑制了chSTING激活的IFN-β启动子活性。为验证这些结果，研究在DF-1细胞中重复实验，使用基于pEGFP-C1的IRF表达载体，得到了一致的结果。这些筛选结果表明，在所测试的chIRF中，只有chIRF7在鸡cGAS-STING激活后介导IFN转录，证实了先前的发现。值得注意的是，研究鉴定出chIRF10是鸡cGAS-STING激活的IFN信号通路的重要抑制剂。
chIRF10作为鸡cGAS-STING-IFN信号通路的负调控因子
随后，对chIRF10的负调控功能进行了进一步表征。首先，使用鸡巨噬细胞系HD11，并用2‘3’-cGAMP（STING激动剂）和poly dA:dT（cGAS激动剂）处理以激活cGAS-STING信号通路。结果显示，chIRF10剂量依赖性地抑制了两种激动剂诱导的chIFN-β启动子激活。类似地，在DF-1细胞中，chIRF10也以剂量依赖的方式抑制chSTING激活的chIFN-β启动子活性。其次，RT-qPCR结果表明，chIRF10显著降低了cGAMP或poly dA:dT在HD11细胞中激活的下游效应基因（IFN-β, MX1, OASL）的mRNA表达。第三，在DF-1细胞中，chIRF10剂量依赖性地抑制了chSTING激活的下游抗病毒基因（IFN-β, MX1, OASL, PKR）的mRNA表达。这些结果共同证实了chIRF10作为鸡cGAS-STING-IFN信号通路负调控因子的作用。
chIRF10抑制由鸡cGAS-STING信号激活的抗病毒效应
团队先前的研究已证明鸡cGAS-STING具有广谱抗病毒作用。为研究chIRF10对cGAS-STING通路抗病毒功能的影响，研究使用了两种RNA病毒（NDV和AIV H1N1）以及两种DNA病毒（痘病毒SMV和VACV）。病毒感染HD11细胞的结果显示，chIRF10显著抑制了cGAMP和poly dA:dT激活的对NDV、H1N1、SMV和VACV的抗病毒效应。类似地，在感染的DF-1细胞中，chIRF10也抑制了chSTING激活的对NDV、SMV和VACV的抗病毒活性。最后，检测了cGAMP刺激和病毒感染后chIRF10的mRNA表达水平。结果显示，在刺激和各种感染后，chIRF10的mRNA表达出现显著且剂量依赖性的上调。
chIRF10的负调控活性依赖于其IRF关联结构域（IAD）
IRF家族成员包含两个关键结构域：DBD和IAD。chIRF10的DBD位于氨基酸6-116，其IAD位于氨基酸203-379。据此，研究构建了chIRF10 ΔDBD和ΔIAD突变体，以研究它们对chSTING激活的IFN信号和抗病毒活性的影响。鸡IFN-β启动子试验结果显示，删除IAD结构域消除了chIRF10对chSTING诱导的IFN信号的负调控活性，而删除DBD结构域则没有这种效应。同时，RT-qPCR结果表明，删除IAD结构域消除了IRF10对chSTING激活后下游基因IFN-β、MX1和OASL表达的抑制作用，而删除DBD结构域则没有影响。最后，抗病毒试验表明，chIRF10 ΔIAD对chSTING激活的抗NDV、SMV或VACV的能力没有影响。相比之下，chIRF10 ΔDBD仍然部分抑制chSTING介导的抗病毒活性，尽管程度较轻。这些结果表明，chIRF10的负调控功能依赖于其IAD结构域。
chIRF10抑制由chSTING下游介质（特别是chIRF7）激活的IFN信号
TBK1和IKKε是STING下游的关键蛋白激酶，而chIRF7是chSTING下游的关键转录因子。因此，研究构建了chTBK1和chIKKε的表达质粒，以检测chIRF10对其激活IFN信号的影响。结果显示，chIRF10轻微下调了chTBK1激活的IFN-β启动子活性，以及chTBK1激活的下游基因（包括IFN-β, MX1, OASL, PKR）的mRNA表达。相比之下，chIRF10显著抑制了chIKKε激活的IFN-β启动子活性以及IFN-β, MX1, OASL, PKR的mRNA表达。类似地，chIRF10显著且强烈地抑制了chIRF7激活的IFN-β启动子活性以及IFN-β, MX1, OASL, PKR的mRNA表达。这些结果表明chIRF10很可能靶向IRF7来发挥其调控作用。
chIRF10直接靶向chIRF7以抑制其激活
为探究chIRF10是否靶向IRF7进行负调控，研究首先调查了chIRF10是否能直接与chIRF7相互作用。共聚焦显微镜结果显示，chIRF10和chIRF10 ΔDBD与chIRF7存在显著的共定位，而chIRF10 ΔIAD与chIRF7的共定位则被消除。类似地，免疫共沉淀试验证明，chIRF10和chIRF10 ΔDBD能够与chIRF7强烈相互作用，而chIRF10 ΔIAD则不能。此外，研究还发现chIRF10也能与chSTING、chTBK1和chIKKε相互作用。
接下来，研究检测了chIRF10是否抑制chIRF7的激活。结果显示，chIRF10显著抑制了chcGAS-STING诱导的chIRF7二聚化，并且这种抑制依赖于chIRF10的IAD结构域。进一步验证表明，chIRF10以浓度依赖的方式抑制chIRF7二聚化。有趣的是，在293T细胞中，共转染chcGAS-chSTING与chIRF7促进了由GFP-chIRF7指示的 distinct speckles（斑点）的形成，而在加入chIRF10后这种斑点形成被抑制，但当引入chIRF10 ΔIAD时，斑点重新出现。这些斑点很可能代表了chIRF7的二聚化或寡聚化形式，表明其处于激活状态。总之，与chIRF10的DBD和IAD缺失突变体的信号活性一致，结果清晰地证明chIRF10通过其IAD结构域与chIRF7相互作用并抑制IRF7的激活。
chIRF10基因敲除增强cGAMP触发的信号激活并抑制HD11细胞中的病毒复制
为进一步阐明chIRF10的负调控作用，研究在HD11细胞中敲除了chIRF10并获得IRF10-/-细胞。在cGAMP刺激下，chIRF10的缺失增强了cGAMP激活的IFN-β、OASL和MX1的mRNA表达。其次，用两个获得的chIRF10-/-HD11细胞克隆感染NDV，发现两个克隆中的病毒复制均显著降低。第三，AIV、SMV和VACV在chIRF10-/-HD11细胞中的复制水平也显著下降。这些发现进一步证实了内源性chIRF10作为cGAS-STING-IFN抗病毒轴负调控因子的作用。
在chIRF10-/-HD11细胞中回补chIRF10及其突变体再次确认其负调控作用
研究已经确定，在缺乏chIRF10的情况下，cGAMP激活的IFN信号上调，病毒复制减少。为进一步验证chIRF10的调控作用，研究将chIRF10及其突变体重组回chIRF10-/-HD11细胞中。首先，检测了回补chIRF10、chIRF10 ΔDBD和chIRF10 ΔIAD后cGAMP激活的IFN信号。与野生型（WT）HD11细胞相比，cGAMP刺激后，chIRF10-/-HD11细胞中IFN相关基因（IFN-β, OASL, MX1）的mRNA水平升高。值得注意的是，回补chIRF10和chIRF10 ΔDBD，而非chIRF10 ΔIAD，降低了这些cGAMP诱导的IFN相关基因的表达。其次，评估了回补chIRF10及其突变体后的病毒复制。相对于WT HD11，chIRF10-/-HD11细胞显示NDV和AIV的复制减少，而在回补chIRF10或chIRF10 ΔDBD后，所有这些病毒的复制均升高，但回补chIRF10 ΔIAD则无此效应。对于SMV和VACV的复制水平，回补后也观察到一致的结果。这些结果进一步阐明了chIRF10对鸡cGAS-STING-IFN抗病毒信号通路的负调控影响。
讨论
已有广泛证据表明chIRF7是chSTING下游的主要IRF，负责结合IFN-β启动子。然而，除chIRF7外，其他鸡IRF家族成员是否参与鸡cGAS-STING-IFN抗病毒信号通路尚属未知。鉴于对鸡IRF的研究有限，本研究首先采用启动子筛选试验，揭示只有chIRF7介导由鸡cGAS-STING触发的I型IFN信号，这与之前的发现一致。此外，研究首次报道了鸡特有的chIRF10显著负调控鸡cGAS-STING-IFN信号通路。
尽管chIRF10早在2002年即被鉴定，但其功能表征仍然匮乏。本研究首次揭示了chIRF10在鸡cGAS-STING-IFN抗病毒反应中的负调控作用，并进一步阐明了其潜在机制。chIRF10在两种鸡细胞系（DF-1和HD11）中有效抑制cGAS-STING激活的IFN信号。团队先前的研究报道了鸡cGAS-STING的广谱抗病毒活性，本研究进一步证实了这一点。对chIRF10功能的进一步研究表明，它显著抑制由鸡cGAS-STING激活的抗病毒信号。此外，本研究发现chIRF10的表达可被病毒感染诱导，这表明chIRF10可能作为一种干扰素刺激基因（ISG）发挥作用，并可能被病毒利用来抑制先天免疫反应和促进免疫逃逸。
与其他IRF家族成员类似，chIRF10包含一个DBD（6-116位氨基酸）和一个IAD（203-379位氨基酸）。本研究发现，是IAD而非DBD的缺失，消除了chIRF10对chSTING介导的IFN激活的抑制作用。此外，IAD的缺失也消除了chIRF10对chSTING触发的抗病毒反应的负调控效应。
chTBK1和chIRF7分别是chSTING下游的关键激酶和转录因子，而IKKε也被认为是哺乳动物STING通路中的重要激酶。本研究表明，chIRF10对chSTING下游组分（包括chTBK1、chIKKε和chIRF7）激活的IFN信号产生不同程度的抑制。有趣的是，chIRF10强烈抑制chIRF7和chIKKε，但对chTBK1仅表现出微弱的抑制，这可能暗示chTBK1下游存在负责I型IFN转录激活的额外转录因子。或者，这也可能是由于chIRF10对两种激酶chIKKε和chTBK1或其激活复合物的亲和力不同。尽管chIRF10与多种信号介质（包括chSTING、chTBK1、chIKKε和chIRF7）存在多方面的相互作用，但鉴于chIRF10的抑制作用依赖于其IAD，chIRF7被认为是chIRF10的主要靶点。
已知IRF的IAD介导与其他IRF蛋白的相互作用。在本研究中，发现chIRF10显著且强烈地抑制chIRF7激活的IFN信号，并且这种调控活性依赖于其IAD。因此，研究调查了chIRF10（及其突变体）与chIRF7之间的相互作用。研究发现chIRF10以依赖于IAD的方式与chIRF7强烈相互作用。与IRF3类似，IRF7形成二聚体后转运入核，启动I型IFN的转录。本研究证明chIRF10抑制由鸡cGAS-STING诱导的chIRF7二聚体形成，并且这种抑制也需要IAD。有趣的是，观察到在293T细胞中表达鸡cGAS-STING促进了由GFP标记的chIRF7指示的 distinct punctate structures（点状结构）的形成。研究认为这种点状模式代表了chIRF7在包含STING的信号复合体中的寡聚状态，表明其处于激活状态。此外，chIRF10（而非chIRF10 ΔIAD）抑制了这种点状结构的形成，这在细胞水平上为chIRF10对chIRF7的负调控作用提供了额外证据。
最后，在HD11细胞中敲除chIRF10导致cGAMP激活的IFN信号显著增强，同时敲除细胞中的病毒复制水平显著降低。在用野生型chIRF10或chIRF10 ΔDBD回补chIRF10-/-HD11细胞后，观察到cGAMP诱导的IFN信号受到显著抑制，同时病毒复制增加。相比之下，用chIRF10 ΔIAD回补的细胞则没有这些效应。这些结果进一步证实了chIRF10在cGAS-STING-IFN抗病毒信号通路中的负调控作用。
总之，本研究首次鉴定了chIRF10在cGAS-STING-IFN抗病毒通路中的负调控功能，并阐明了其潜在机制：chIRF10靶向chIRF7，通过结合和物理隔离干扰chIRF7二聚化，从而抑制chIRF7的激活。由于鸡缺乏IRF3，chIRF7是I型IFN诱导的唯一主要转录因子。在此背景下，chIRF10的抑制作用尤为关键，因为IRF7和IRF3之间不存在功能冗余。因此，chIRF10作为禽类先天免疫中的“主刹车”发挥着独特作用，标志着其进化的重要性。
