《Frontiers in Microbiology》：Triplex viability PCR for simultaneous quantification of Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, and Bifidobacterium bifidum in live microbial formulations
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本文开发了一种三重PMA-qPCR（vPCR）技术，可同步定量检测活菌制剂中的乳酸杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌。该方法通过优化引物探针组合、PMA浓度（25 μM）和扩增条件，实现了对三种菌株的高特异性检测（R2>0.98，效率90%-110%），有效区分活/死菌（检测限10-30 CFU/mL）。应用于商业产品时，vPCR结果显著高于平板计数但低于标准qPCR，凸显其精准量化活菌的优势，为多菌种制剂质量控制提供了高效解决方案。
引言
近年来，随着对特定活微生物菌株有益作用认识的深化，含有高浓度活微生物的产品（如益生菌膳食补充剂和活生物治疗产品LBPs）日益增多。此类制剂常同时含有乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）。准确评估各菌种的存活数量对确保产品功能性和符合监管要求至关重要。传统平板计数法存在耗时长、灵敏度低、无法区分菌种等局限。尽管已有基于核酸的方法（如PCR）用于微生物检测，但多数无法同步实现菌种鉴定、活菌定量和存活状态评估。前期研究虽建立了乳酸杆菌和双歧杆菌的单重vPCR方法，但多重检测技术仍属空白。本研究通过开发三重vPCR方法，实现了三种关键菌株的同步快速检测。
材料与方法
实验采用三种目标菌株（乳酸杆菌DSM 20079、嗜热链球菌DSM 20617、双歧杆菌DSM 20456）和八种非目标菌株进行特异性验证。通过100°C加热处理制备灭活菌液（嗜热链球菌需30分钟完全灭活）。使用25 μM浓度的PMA处理菌液，经暗孵育和光活化后选择性抑制死菌DNA扩增。DNA提取采用商业化试剂盒，三重qPCR反应体系包含三种菌株的特异性引物探针（分别标记不同荧光基团），扩增程序为95°C 2分钟预变性，继以45循环的95°C 10秒变性/60°C 30秒退火延伸。以平板计数结果为基准，建立菌落形成单位（CFU）与循环阈值（Ct）的标准曲线。最终方法应用于商业胶囊产品检测，并与平板计数、标准qPCR结果对比。
结果
- 1.
方法优化：新设计的嗜热链球菌引物探针靶向ATPase V基因，经BLAST分析和体外实验验证具备高特异性。三重qPCR可同步产生三条独立扩增曲线，标准曲线线性良好（R2>0.98），效率达90%-110%。PMA浓度测试表明，25 μM在有效抑制死菌扩增的同时对活菌毒性最小。
- 2.
检测性能：方法对乳酸杆菌和双歧杆菌的检测限为10 CFU/mL，嗜热链球菌为30 CFU/mL。活/死菌混合实验中，PMA处理组Ct值无显著差异，证实死菌信号被有效屏蔽。
- 3.
实际应用：商业产品检测显示，平板计数结果普遍低于两种qPCR方法，而vPCR值介于二者之间，其中双歧杆菌的vPCR与qPCR结果差异显著。三种方法测得菌量均高于产品标示值，可能为保障货架期活性而添加的富余菌量。
讨论
本研究首次将多重qPCR与PMA技术结合，成功实现三种益生菌的同步活菌定量。该方法通过优化荧光基团组合（以ROX为内参）和反应体系，避免了交叉干扰。25 μM PMA的选用既保障死菌信号抑制，又最小化细胞毒性，较既往研究常用浓度（50-100 μM）更具优势。与平板计数相比，vPCR能检测到包括VBNC状态在内的全部活菌；与标准qPCR相比，其排除了死菌DNA干扰，结果更贴近真实活菌数。方法检测限（101-107CFU/mL）完全覆盖益生菌制品常规浓度范围（106-109CFU/g），为多菌种制剂的质量控制提供了高通量、低变异性的解决方案。未来需进一步验证方法在不同基质中的适用性，而菌株水平区分则需开发基于特异基因标记的探针。
