《Plant Biotechnology Journal》：CpERF-WRI1 Manipulates Ethylene Sensing by Regulating the Expression of CpERS1 and Fruit Ripening in Papaya
乙烯信号感知与番木瓜果实成熟的调控网络
引言
肉质果实的成熟是一个复杂的过程，涉及外观、质地、香气、风味和营养价值的改变。根据成熟过程中的呼吸作用和乙烯产生特征，肉质果实可分为跃变型和非跃变型。跃变型果实在成熟开始时会出现乙烯产生和呼吸速率的快速上升，而非跃变型果实则没有这种显著变化。乙烯在植物发育、衰老和果实成熟调控中发挥着核心作用，其效应主要依赖于生物合成的控制和信号转导途径的介导。
植物拥有两种乙烯生物合成系统：系统I在整个植物生长和应激反应中产生乙烯，而系统II负责花朵衰老和果实成熟期间的乙烯产生。系统I通过自我抑制运作，而系统II是乙烯刺激和自催化的。乙烯在跃变型果实成熟中的作用主要归因于系统II。
番木瓜主要在炎热潮湿的夏季采收，易出现黄化、软化和采后腐烂问题。同时，番木瓜对低温高度敏感，运输和贮藏过程中的冷害会导致严重损失。1-MCP作为一种无毒乙烯拮抗剂，能有效延迟番木瓜和其他多种果实的成熟，但不当使用会诱导成熟障碍。
CpERF-WRI1和CpERS1表达与果实成熟和软化障碍密切相关
作为典型的跃变型果实，番木瓜在采后迅速成熟，并对乙烯高度敏感。适当的1-MCP处理能有效延迟成熟和软化，而长时间暴露则会抑制成熟并产生异常果实质地，最终导致贮藏期间的不正常软化。
研究发现，不当的1-MCP处理会显著抑制CpERF-WRI1和CpERS1的表达。除了不当的1-MCP处理外，冷害和热应激也会在番木瓜中诱导软化障碍。RNA-seq分析确定了在导致软化障碍的处理中共有的24个差异表达基因，CpERF-WRI1是这些关键差异表达基因之一。
通过RT-qPCR验证发现，在对照条件下，乙烯处理强烈诱导CpERF-WRI1表达，在第6天达到峰值，约为第0天的1200倍。适当时间的低剂量1-MCP处理将这个峰值延迟到第11天，之后表达下降。相比之下，长时间的不当1-MCP暴露严重抑制了CpERF-WRI1的表达，即使在乙烯应用后，其在贮藏期间仍保持低水平。
CpERS1表达也显示出相似的模式：对照果实表现出CpERS1的快速诱导，在第2天达到峰值后下降，而长时间的不当1-MCP强烈抑制CpERS1表达，其在贮藏期间保持低水平。这些数据建立了CpERF-WRI1和CpERS1表达降低与不当处理下1-MCP诱导的软化障碍发生之间的强关联。
CpERF-WRI1和CpERS1与系统II乙烯感知和响应密切相关
成熟绿色番木瓜暴露于外源乙烯会激活系统II乙烯生物合成，启动正常成熟和软化，而在未成熟绿色果实中未观察到这种响应。外源乙烯迅速降低成熟果实的硬度，同时乙烯产生和呼吸速率急剧增加。相比之下，未成熟绿色果实即使在30天后也无法正常成熟或软化，表现出持续低的乙烯产生和呼吸，同时显示出软化障碍的症状。
相应地，CpERF-WRI1和CpERS1转录水平在成熟果实中经过乙烯处理后迅速上升到高水平，但在未成熟果实中保持低位。使用RNA-seq数据，研究人员检查了在其他产生类似软化障碍的条件下CpERF-WRI1和CpERS1的表达。不当的1-MCP处理强烈抑制了这两个基因。遭受严重冷害的果实已知对乙烯不敏感，但会出现软化障碍；在冷藏温度下储存或从冷藏温度转移并随后用乙烯处理的果实中，CpERF-WRI1和CpERS1表达在整个贮藏和成熟期间保持稳定低位。同样，高温应激（>35°C）会诱导软化障碍，即使在乙烯处理后也表现为不完全成熟，在高温贮藏处理中，即使在乙烯应用后，这两个基因也被严重抑制。
组织特异性表达分析显示，CpERF-WRI1在根、叶、幼果和成熟果实中高表达，而CpERS1表达在器官和发育阶段相对稳定，在根和黄色果肉中水平略高。
CpERF-WRI1和CpERS1的特征分析
通过序列比对检测到保守的AP2/ERF DNA结合结构域。系统发育分析将CpERF-WRI1置于番茄SlERF.F2附近，表明功能相似性。亚细胞定位实验证实CpERF-WRI1是核定位的，与其预测的作为转录因子的作用一致。
研究人员对番木瓜中的乙烯受体基因进行了全基因组鉴定，确定了四个成员：CpERS1、CpERS2、CpEIN4和CpETR1。对来自番木瓜、番茄和拟南芥的ERS/ETR家族的系统发育分析将CpERS1和CpETR1归入亚家族I，表明与这些物种的ERS1同源物有密切关系。基序分析揭示了CpERS1、CpEIN4、CpETR1及其在拟南芥和番茄中的对应物中有五个保守基序，两个亚家族中的基序分布相似。相比之下，CpERS2仅包含这些保守基序中的两个。在四个番木瓜ETR中也观察到不同的功能结构域，与潜在的功能分化一致。最后，定位研究显示CpERS1与膜标记物共定位，支持其在膜相关乙烯信号中的作用。
CpERF-WRI1调控CpERS1的表达
研究人员分析了CpERS1启动子并鉴定了一个GCC-box样基序。为了测试CpERF-WRI1是否直接结合该元件，进行了酵母单杂交和电泳迁移率变动分析，两者都证实了CpERF-WRI1与CpERS1启动子的相互作用。使用双荧光素酶系统，观察到在存在CpERF-WRI1的情况下启动子活性显著高于对照转染。在番木瓜叶片中瞬时过表达CpERF-WRI1导致CpERF-WRI1转录物的强烈诱导和CpERS1表达的相应增加。这些结果表明，CpERF-WRI1直接结合CpERS1启动子并激活其转录。
CpERF-WRI1表达改变影响番木瓜果实成熟
为了确定CpERF-WRI1在番木瓜成熟中的作用，研究人员使用了瞬时过表达和VIGS介导的沉默技术。CpERF-WRI1的瞬时过表达显著加速了成熟：过表达果实比空载体对照显示出更快的果皮黄化，在16小时1-MCP处理后这种效应更加明显。在对照和1-MCP条件下，过表达果实中的CpERF-WRI1转录水平显著高于空载体对照，CpERS1表达被显著诱导。过表达子显示出与 advanced 着色一致的改变的h°值，与空载体果实相比，在正常条件和1-MCP处理后，硬度下降更快，乙烯产生和呼吸速率增加。当过表达在仍在树上的果实上进行时，接种后三天可见加速的着色和采后成熟。在过表达果实上的ChIP-qPCR证实，与对照和1-MCP处理中的预免疫IgG相比，带有抗FLAG CpERF-WRI1抗体的CpERS1启动子片段特异性富集，支持直接结合。
相比之下，VIGS介导的CpERF-WRI1抑制延迟了成熟。基因沉默果实在注射部位和相邻组织发育出持久的绿色斑块，其颜色变化在正常成熟和短时间（2小时）1-MCP处理下与pTRV2空载体对照显著不同。沉默果实显示出不同的h°值，并在后期成熟阶段保持显著高于对照的硬度。CpERF-WRI1和CpERS1转录水平在沉默果实中显著降低，乙烯产生和呼吸速率被显著抑制。
这些结果表明，CpERF-WRI1通过增加乙烯产生促进番木瓜成熟和软化，至少部分通过直接转录激活CpERS1，并且CpERF-WRI1过表达可以部分减轻1-MCP对成熟的抑制作用。
CpERF-WRI1过表达增强番茄果实的乙烯产生和成熟
研究人员通过异位过表达CpERF-WRI1在Micro-Tom番茄中进一步表征了该基因，产生了十多个独立的转基因系，许多显示出均匀加速的果实成熟。选择了三个独立的高表达系进行详细分析，所有系都促进了更早的果实成熟和成熟。从花后天数到破色期的间隔在过表达系中显著缩短，而从破色期到完全成熟的时间没有显著差异。CpERF-WRI1过表达也加速了软化：过表达果实在成熟期间显示出更快的硬度下降，并在后期成熟期表现出比野生型更高的呼吸速率和乙烯产生。此外，过表达拓宽了乙烯产生谱：野生型乙烯在破色期+2天达到峰值，而过表达系在破色期+2天和破色期+4天都显示出相当的峰值。这些数据表明，CpERF-WRI1过表达加速了番茄果实成熟并促进了成熟相关的生理变化。
CpERF-WRI1表达改变影响番茄果实的全基因组转录谱
RNA-seq分析用于比较CpERF-WRI1过表达对野生型、OE9和OE10番茄果实在破色期和破色期后四天成熟的影响。序列统计和样本相关性分析确认了数据质量和适合下游分析。在过表达系中检测到比野生型在不同成熟阶段更多的差异表达基因。在野生型中，在破色期和破色期+4天之间鉴定了3656个差异表达基因；CpERF-WRI1过表达将这个数字增加到OE9中的6097和OE10中的8485。分析还鉴定了在破色期OE9和OE10与野生型相比的4691和4788个差异表达基因，在破色期+4天分别为2581和3116个差异表达基因。
KEGG分析显示，在成熟野生型果实中的差异表达基因主要与光合作用、次级代谢物生物合成、皮质醇和类固醇激素合成、角质/木栓质/蜡质生物合成、半乳糖代谢、类黄酮生物合成和果糖/甘露糖代谢相关。在破色期OE9和OE10系与野生型相比，诸如Toll和LMD信号、MAPK信号、NF-κB信号、Toll样受体信号、植物-病原体相互作用和亚油酸代谢等通路被富集。在破色期+4天，苯丙烷类生物合成、苯丙氨酸代谢和类黄酮生物合成在过表达系中与野生型相比显著富集。这些比较中上调和下调的差异表达基因显示出大致相似的通路富集。
研究人员进一步检查了CpERF-WRI1过表达是否影响番茄中的关键SlERF基因。过表达对大多数关键SlERF仅产生微小影响，没有明显的上或下调，除了SlERF1，其在CpERF-WRI1过表达系中被下调。
CpERS1表达改变影响番木瓜果实成熟
通过瞬时过表达和VIGS介导的沉默在番木瓜中检查了CpERS1在成熟中的作用。CpERS1过表达果实比对照发育颜色更快，并显示CpERS1转录物的强烈上调。这些过表达子在成熟期间表现出比空载体对照更快的硬度损失和显著更高的乙烯产生和呼吸速率。颜色参数也在CpERS1过表达果实中与野生型相比显著改变。
相比之下，CpERS1沉默果实显示出更明显的成熟缺陷，颜色变化显著延迟。沉默果实在浸润部位发育出显著的绿色斑块，并显示CpERS1表达的强烈减少，确认有效沉默。它们保持显著更高的硬度，并表现出比对照更低的乙烯产生和呼吸速率。VIGS果实中的颜色发育与pTRV2空载体对照显著不同，L、C和h°值发生显著变化。
为了研究软化的下游效应物，研究人员通过RT-qPCR在瞬时过表达和VIGS沉默果实中测量了关键细胞壁相关基因的表达。与软化相关的基因——CpPG-like1、CpPG-like2、CpEXP-A8-like、CpEXP-A4、CpXYL、CpSUS2和Cp-β-Glu46——在CpERS1过表达果实中被显著诱导，在沉默果实中与对照相比被下调。这些数据表明，CpERS1作为番木瓜果实成熟和软化的正调节因子发挥作用。
CpERS1表达改变影响番木瓜的全基因组表达谱
RNA-seq在采后0天和用空载体或CpERS1沉默构建体处理5天后进行，以评估CpERS1对成熟的影响。测序统计和样本相关性确认了数据质量适合下游分析。在成熟期间和在KD与载体对照果实之间检测到大量差异表达基因。
比较0天与V-5d（空载体成熟）鉴定了5329个差异表达基因，与参与成熟过程的基因一致。在KD果实中，发现了4740个差异表达基因。直接比较V-5d与KD-5d揭示了仅748个差异表达基因，维恩分析显示所有三个比较中共有357个差异表达基因，表明这些基因可能在成熟中发挥核心作用。
0天与V-5d的KEGG富集前20通路包括植物-病原体相互作用、苯丙烷类生物合成、碳代谢、ABC转运蛋白、淀粉和蔗糖代谢以及脂肪酸代谢。0天与KD-5d的富集通路包括异黄酮生物合成、谷胱甘肽代谢、MAPK信号、脂肪酸降解、淀粉和蔗糖代谢以及几个在0天与V-5d比较中也看到的通路，如苯丙烷类生物合成和ABC转运蛋白。V-5d与KD-5d比较显示在脂肪酸降解、苯丙烷类生物合成、ABC转运蛋白和酪氨酸代谢中富集。这些结果表明，降低的CpERS1表达显著影响苯丙烷类生物合成、ABC转运蛋白、糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢以及碳代谢。
热图分析进一步显示，沉默CpERS1显著改变了在番木瓜果实成熟期间参与激素信号、淀粉和糖代谢、MAPK信号以及脂肪酸代谢/降解的关键基因的表达。
CpERS1过表达加速番茄果实成熟
为了验证CpERS1在果实成熟中的功能，研究人员产生了稳定的CpERS1过表达番茄植物。获得了十多个独立的转基因系，许多显示出均匀、加速的成熟。选择了三个具有确认高CpERS1表达的代表性系进行详细分析；所有三个系显示一致更早的成熟。从花后天数到破色期间的间隔在过表达系中与野生型相比显著缩短：OE1在大约30天达到破色期，OE2和OE3在大约32天，而野生型在大约39天达到破色期。过表达系还显示出从破色期到完全成熟缩短的过渡和与野生型相比更大的硬度损失。
过表达系中的乙烯产生各不相同：OE2表现出相对于野生型增加的乙烯，而OE1和OE3显示较低的乙烯水平。所有过表达系显示出比野生型更显著的颜色变化。七个内源番茄ETR基因的分析揭示了在野生型和过表达系中相似表达趋势，大多数ETR在成熟期间被抑制，表明CpERS1过表达可能调节内源ETR表达，从而改变成熟动态。
研究人员还检测了参与乙烯信号、细胞壁分解和成熟调节转录因子的成熟相关基因；大多数在过表达系中相对于野生型在不同成熟阶段被上调。这些数据表明，CpERS1过表达加速番茄果实成熟并广泛激活成熟相关的转录程序。
CpERS1和CpERF-WRI1过表达改变对乙烯的敏感性
当幼苗在空气中黑暗生长时，过表达CpERS1下胚轴伸长显著更快且比野生型更长，而过表达CpERF-WRI1与野生型没有显著差异。在10μM ACC处理下，过表达CpERF-WRI1和过表达CpERS1的下胚轴都显著短于野生型。相比之下，在1μL·L?11-MCP处理下，过表达CpERF-WRI1下胚轴显著短于野生型，而过表达CpERS1下胚轴显著更长。这些结果表明，CpERF-WRI1和CpERS1的过表达都增加了乙烯敏感性，在过表达CpERS1系中效应更强。
讨论
番木瓜是典型的跃变型果实，其成熟受到乙烯的密切调控。1-MCP作为一种无毒乙烯拮抗剂，结合乙烯受体并阻断信号，从而延迟番木瓜成熟。不当的1-MCP应用也会诱导软化障碍，产生因乙烯感知受损而无法完全软化的果实。因此，乙烯受体及其信号通路在这种障碍的发展中至关重要。
先前的研究使用RNA-seq和代谢分析鉴定了几个可能参与该障碍的候选基因，包括ACS10、EBF1、ERF-WRI1、ERF110（乙烯信号）、多聚半乳糖醛酸酶和内木聚糖酶（细胞壁代谢）以及苯丙烷通路中的基因。结合代谢组学和转录组学工作进一步暗示苯丙烷代谢、乙醇酸循环和三羧酸循环是受不合适1-MCP处理影响的主要通路。
早期工作显示，转录因子CpMADS1/3调节细胞壁降解基因，这些基因被不当的1-MCP应用严重抑制，导致软化障碍。最近，CpAGL18，一个激活乙烯和生长素信号的MADS-box转录因子，被显示结合关键成熟基因的启动子，介导番木瓜成熟期间的乙烯-生长素串扰；不当的1-MCP应用强烈抑制CpAGL18表达，从而损害乙烯和生长素信号，导致软化障碍。这些研究主要涉及软化的下游调节因子，而不是乙烯受体本身，这些受体是不当1-MCP使用的直接靶标。
在本研究中，研究人员通过功能表征CpERF-WRI1和乙烯受体CpERS1扩展了这项工作。结果表明，CpERF-WRI1和CpERS1都正向调节番木瓜成熟，并与不当1-MCP处理诱导的成熟障碍有关。研究人员进一步证明CpERF-WRI1调节CpERS1表达，表明在系统II乙烯信号通路内调节乙烯感知的作用。这些发现显著提高了我们对番木瓜中乙烯感知和成熟控制的理解。
环境应激也会损害乙烯感知并导致成熟障碍。低温会导致冷害，破坏苯丙烷代谢、次级代谢、淀粉到蔗糖的转化、激素信号和细胞壁多糖降解，导致即使在乙烯暴露后也会出现成熟和软化缺陷。相反，在高于35°C的温度下储存或运输会产生具有橡胶质地和不完全软化的果实；热应激影响木质素生物合成、乙烯生物合成、蔗糖代谢和细胞壁降解。这些不利条件会损害乙烯感知，阻止果实响应外源乙烯并启动成熟。
鉴于这些观察，研究人员分析了各种应激下的ETR基因表达，并确定CpERS1为番木瓜中的关键乙烯受体。CpERS1表达在正常成熟期间逐渐增加，但被适当的1-MCP适度抑制，被长时间的1-MCP暴露强烈抑制，并被冷害和热应激严重抑制——这些变化与软化障碍相关。具有低CpERS1水平的未成熟果实无法建立系统II乙烯，不响应乙烯并发育软化障碍；即使在外源乙烯处理后，CpERS1在这些未成熟果实中仍被抑制。在番木瓜中瞬时过表达和VIGS沉默CpERS1显示，改变CpERS1表达影响乙烯产生和成熟进程，支持CpERS1作为番木瓜果实中系统II乙烯信号的乙烯感知和受体功能的关键组分的作用。
规范的乙烯信号模型将乙烯受体定义为响应的负调节因子：换句话说，受体水平的降低通常会增加乙烯敏感性。在缺乏乙烯时，受体主动抑制乙烯响应，而在果实成熟期间乙烯有效地持续存在。在番茄中，六个SlETR在成熟期间显示差异的、跃变型表达模式，但被1-MCP处理抑制。其中，SlETR3和SlETR4是最高度乙烯响应的，可能对乙烯信号和成熟很重要。SlETR1和SlETR3的突变赋予乙烯不敏感性并延迟成熟。显示GAF结构域中的突变增加了乙烯敏感性，而乙烯结合和GAF结构域之间的突变降低了敏感性。NR受体基因，在颜色转变期间正常上调，在SlETR5-1中进一步上调但在SlETR4-1中被下调，强调不同的ETR异构体可以差异影响乙烯信号。因此，尽管ETR被广泛描述为负调节因子，但个体ETR家族成员在果实成熟控制中可以具有独特且有时相反的作用。
乙烯受体影响许多物种的果实成熟和衰老，但剖析个体受体功能是困难的，因为受体由具有重叠功能的多基因家族编码。然而，对不同作物中单个受体的研究揭示了多样且有时反直觉的模式。例如，在桃中，PpERS1转录水平在成熟期间增加并被1-MCP抑制，而PpETR1基本保持不变。在苹果中，MdETR1转录物随乙烯积累上升，而MdERS1在成熟和衰老期间保持稳定；两种转录物都被1-MCP抑制。在香蕉中，MaERS1和MaERS3在快速和缓慢成熟品种中显示差异上调。中国白菜的采后储存不改变BcETR1但导致BcERS1、BcETR2和BcERS2的瞬时变化；外源乙烯诱导它们的表达而1-MCP抑制它。在草莓中，FaETR1和FaETR2在成熟期间增加并响应乙烯。类似的成熟相关上调某些ETR基因已在番茄、苹果、葡萄和柑橘中报道。
这些在成熟期间的转录增加乍一看似乎与乙烯受体作为乙烯响应的负调节因子的规范观点冲突。然而，蛋白质水平分析有助于调和这种差异。测量番茄发育期间的mRNA和蛋白质发现，受体蛋白丰度在未成熟果实中最高，然后在成熟开始时急剧下降，与转录趋势相反；乙烯加速受体蛋白降解，从而在蛋白质水平调节成熟。类似地，在番茄中使用定量蛋白质组学显示，尽管Nr突变体中SlETR3转录物丰度降低，但SlETR3蛋白在成熟期间积累并有助于突变体果实的乙烯不敏感性。也报道了SlETR3和SlETR4蛋白水平在成熟期间增加，在跃变乙烯爆发后达到峰值。一个合理的解释是，在成熟开始时，新受体合成的速率可能超过特定异构体的乙烯诱导降解速率；因为受体减弱乙烯信号，受体丰度的瞬时上升可能降低乙烯敏感性并有助于微调成熟的时间和进程。更高的受体负载也可能缓冲自催化乙烯激增，防止信号的不受控制的放大。总之，这些观察指出复杂的乙烯信号调节，依赖于受体蛋白的转录和翻译后控制。
在本研究中，1-MCP似乎以稳定受体并防止其正常乙烯触发降解的方式结合CpERS1，从而延迟或阻断成熟。功能上，CpERS1的行为不同于规范的负调节因子模型：它积极促进成熟，并且CpERS1过表达在番茄中增加了乙烯敏感性。此外，似乎需要CpERS1的阈值水平来建立系统II乙烯和成熟开始。这些发现表明，CpERS1在乙烯受体中具有独特性质，并且受体功能受到复杂翻译后机制的调节。
因此，未来的工作应聚焦于CpERS1和其他乙烯受体的翻译后调节——如磷酸化、泛素化或调节蛋白水解——以阐明受体丰度和活性在果实发育期间以及响应1-MCP和环境应激时如何被控制。
ETR基因是乙烯信号和果实成熟控制的核心组分，但个体乙烯受体如何被特异性调节和再生相对未被探索。在本研究中，研究人员确定CpERS1为番木瓜系统II乙烯感知的关键受体，并显示其表达受到ERF转录因子CpERF-WRI1的调节。
ERF家族转录因子作为乙烯信号的终端效应子和许多成熟过程的关键调节因子。例如，CpERF9在番木瓜成熟期间下降，但直接结合细胞壁修饰基因的启动子，暗示其在质地变化中的作用。在香蕉中，MaERF11通过靶向扩张蛋白基因和MaACO1抑制成熟，而MaERF96L和MaERF012通过激活MaGWD1和几个淀粉和细胞壁相关基因促进软化。在苹果中，MdERF2和MdERF3协调抑制MdACS1并调节乙烯产生、成熟和花青素积累。在柑橘和其他物种中，ERF整合乙烯与额外激素或应激通路以控制颜色和品质性状。总之，这些例证说明ERF通过调节乙烯和其他植物激素网络来协调成熟的多个方面。
研究人员的结果将CpERF-WRI1置于这个调节框架中，但具有新作用：它直接结合并激活CpERS1，编码关键乙烯受体CpERS1的转录物。CpERF-WRI1过表达或沉默强烈改变番木瓜成熟，维恩分析确定CpERF-WRI1在与长时间1-MCP处理、冷害和热应激诱导的软化障碍相关的共同基因中。研究人员显示，长时间的1-MCP暴露和温度应激严重抑制CpERF-WRI1表达；这种抑制阻止CpERS1的再生，使果实对乙烯不敏感并导致软化障碍。因此，与先前表征的主要作用于下游成熟效应物的ERF不同，CpERF-WRI1似乎通过调节系统II信号所需的乙烯受体的产生而上游作用。
总之，由长期1-MCP处理、冷害或热应激诱导的软化障碍主要归因于乙烯受体再生受损和随之而来的乙烯不敏感性。CpERS1作为番木瓜中的关键系统II受体发挥作用，并且CpERF-WRI1需要激活CpERS1表达。当CpERF-WRI1被不当的1-MCP应用或温度应激抑制时，CpERS1无法补充，乙烯感知失败并发生软化障碍。
