《Journal of Agriculture and Food Research》：A Microbial Biorefinery for Chitin and
N-Acetyl Chitooligosaccharides from Shrimp Shell Waste
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本研究针对虾壳废弃物(SSW)传统化学处理法污染重、效率低的问题，开发了一种微生物联合发酵的绿色精炼技术。通过Pseudomonas sp. GXUN-7、Lacticaseibacillus sp. GXUN-G1和Bacillus sp. GXUN-J6三株菌的序贯发酵，实现了蛋白质（脱除率99.39%）、矿物质（脱除率97.38%）和甲壳素的高效分离转化，并获得具有促生长、抗氧化和免疫诱导活性的高附加值产物（NACOS等），为甲壳类废弃物的循环利用提供了环境友好型解决方案。
随着全球水产养殖业的蓬勃发展，2022年甲壳类产量已达到1030万吨。然而这些甲壳动物的可食用部分不足总生物量的一半，每年加工过程中产生数百万吨废弃物。目前这些虾壳废弃物（SSW）主要通过填埋和焚烧处理，仅有少量用于工业甲壳素提取，不仅造成严重的环境污染，更浪费了其中蕴含的宝贵生物活性成分。虾壳中含有30-40%的蛋白质、20-30%的甲壳素以及30-40%的矿物质，这些成分都具有转化为高附加值产品的巨大潜力。
传统甲壳素提取方法需要大量使用盐酸和氢氧化钠，每生产1吨甲壳素就会产生约300吨高浓度含盐有机废水。一个年产能3000吨的工厂每年排放近90万吨废水，这些废水呈暗黑色、散发恶臭、富营养化严重，对水产养殖生态系统和人类居住区构成威胁，甚至可能引发赤潮等有害藻华。虽然酶法回收技术显示出良好前景，但高昂的酶生产成本、繁琐的纯化程序以及对环境波动的敏感性，限制了其在复杂工业环境中的长期运行稳定性。
针对这一严峻问题，广西民族大学海洋科学与生物技术学院的研究团队在《Journal of Agriculture and Food Research》上发表了一项创新性研究，开发了一种微生物生物精炼策略，用于虾壳废弃物的综合高值化利用。该研究通过筛选特定的微生物菌株，建立了一套完整的发酵工艺，实现了虾壳中蛋白质、矿物质和甲壳素的高效分离和转化，为替代传统化学处理方法提供了可持续的解决方案。
研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究。首先通过功能筛选从实验室自有菌种库中获得了三株核心菌株：脱蛋白菌Pseudomonas sp. GXUN-7、脱矿化菌Lacticaseibacillus sp. GXUN-G1和甲壳素降解菌Bacillus sp. GXUN-J6。研究采用正交实验设计优化发酵参数，运用扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和X射线衍射(XRD)对产物进行结构表征，通过薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析降解产物组成，并采用体外抗氧化、抗菌活性和植物免疫酶活性测定等方法评估产物生物活性。实验所用虾壳样本来自南宁市海鲜加工厂的南美白对虾(Litopenaeus vannamei)壳。
3.1. 脱蛋白菌株筛选及发酵产物分析
研究人员首先对原始虾壳废弃物进行组分分析，发现其含有29.45%的蛋白质、15.42%的甲壳素、32.14%的灰分和11.61%的水分。通过蛋白酶活性筛选，从实验室菌种库中获得了7株具有显著蛋白酶活性的候选菌株。二次发酵筛选显示，菌株GXUN-7表现最佳，脱蛋白效率达到99.39%，残留蛋白质含量仅为0.44%。回收的蛋白质水解产物中，游离氨基酸(FAA)占51.43%，肽类占48.57%。氨基酸组成分析显示，必需氨基酸(EAA)占比高达63.58%，其中鲜味氨基酸占53.97%，甜味氨基酸占7.68%，支链氨基酸占27.67%。与需要大量外肽酶的传统酶法相比，微生物蛋白酶介导的水解方法大幅降低了底物成本。
3.2. SPH对烟草的促生长作用
通过化学评分分析发现，大多数必需氨基酸的化学评分超过100%，表明其能满足人类和动物的营养需求。烟草幼苗促生长实验显示，10倍稀释的虾壳蛋白水解物(SPH)显著促进地上部生长，而未经稀释的SPH强烈抑制根系发育。根系反应呈现浓度依赖性：10倍和20倍稀释分别使根长增加101%和76%，而5倍稀释使根长减少19.7%。适度的SPH浓度刺激分生组织活性和侧根形成，增强水力传导性和矿物质吸收能力。作为有机氮源，氨基酸可直接被植物吸收，规避了氮转化所需的耗能步骤，因此处理植株的鲜重和干重均显著增加。
3.3. 脱矿化菌株筛选、工艺优化及产物表征
研究人员从实验室菌种库中筛选出5株高产酸菌株进行二次发酵筛选。初始条件下，菌株GXUN-G1的脱矿化效率为54.59%，未能满足下游应用所需的高纯度甲壳素要求。通过单因素实验和正交实验设计优化，确定最佳参数为：2%脱蛋白壳(DPS)、7.5%葡萄糖、0.75%酵母浸粉、30°C。验证实验显示脱矿化效率达到97.38%，较初始值提升78.38%。优化后的GXUN-G1发酵液主要含有乳酸(36.24 g/L)和乙酸(0.47 g/L)，pH为3.86。上清液中含有乳酸钙和抗菌细菌素，可作为植物钙补充剂和生物农药使用。
3.4. 高纯度、高乙酰度甲壳素的回收
经过GXUN-7脱蛋白和GXUN-G1脱矿化顺序处理后获得的甲壳素产品，其结构表征显示与商业甲壳素相当。扫描电镜分析表明，原始虾壳呈现甲壳动物外骨骼特有的生物微观结构，表面粗糙、褶皱，附着蛋白质-矿物质复合物。脱蛋白处理后形成大孔结构，脱矿化后产生碎片状、海绵状甲壳素，矿物质去除效率达97.5%。傅里叶变换红外光谱显示，虾壳甲壳素在1659和1627 cm-1处出现特征酰胺I带，在1555 cm-1处出现酰胺II带。X射线衍射分析显示提取的甲壳素在9.35°(020)、12.75°(021)和19.47°(110)处出现反射峰，与α-甲壳素结构一致。滴定法测定乙酰化度(DA)为88.93%，显著高于商业标准品的77.81%，表明天然N-乙酰基团得到近乎完全保留。
3.5. 高效甲壳素降解菌株筛选及产物分析
通过甲壳素琼脂平板初筛和发酵液复筛，研究人员发现菌株GXUN-J6表现出最优异的甲壳素酶活性。发酵时间进程监测显示，在第2-3天甲壳素酶活性显著增加，最高活性在第3天达到1.65 U/mL。甲壳素水解产物(CHP)浓度持续上升至第6天，第7天达到最大产量8.89±0.06 mg/mL。薄层色谱分析显示，聚合度(DP)>5的寡聚物从第2天开始积累，第3天更加明显。高效液相色谱分析鉴定出六个主要峰，其中三个与NAG、(NAG)2和(NAG)6标准品共洗脱。电喷雾电离质谱(ESI-MS)显示一系列质量峰间隔203 Da，与单个N-乙酰葡萄糖胺残基的质量一致，直接证实产物为NACOS和NAG的混合物。CHP的乙酰化度为86.77%，与天然甲壳素无显著差异。
3.6. 虾壳甲壳素水解产物的生物活性
体外抗氧化实验显示，CHP对DPPH和羟基自由基的EC50值分别为0.67 g/L和0.74 g/L。抗菌实验表明，CHP对三种植物病原菌——尖孢镰刀菌古巴专化型(Foc)、烟草疫霉(P. nicotianae)和弯孢菌(C. lunata)均有显著抑制作用，其中对烟草疫霉的抑制接近完全。免疫诱导实验显示，CHP处理可激发系统获得性抗性，触发预免疫激活。超氧化物歧化酶(SOD)活性在处理后12、24和36小时均显著高于对照，12小时时达到峰值，比对照增加89%。过氧化物酶(POD)活性在24小时达到峰值，比对照高0.21倍。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性在24小时增加62%，通过次级代谢产物生物合成和信号传导增强疾病抗性。
3.7. 虾壳废弃物微生物精炼工艺的建立
研究最终建立了一个完整的微生物精炼工艺流程：第一步，原始虾壳经粉碎后通过GXUN-7进行脱蛋白，脱蛋白效率达99.39%，获得富含蛋白质水解物的上清液；第二步，脱蛋白壳通过菌株GXUN-G1进行脱矿化，脱矿化效率达97.38%，获得富含钙的上清液和甲壳素组分；第三步，通过菌株GXUN-J6将分离的甲壳素酶转化为可溶性CHP，生成具有异质聚合度的寡聚物。每100克虾壳废弃物可产出28.94克蛋白质水解物、30.16克矿物质补充剂、9.24克甲壳素和6.88克CHP。
该研究建立的微生物生物精炼工艺实现了虾壳废弃物的全组分高值化利用，相比传统化学方法，微生物发酵技术生产的甲壳素和NACOS生物活性更强，获得的高附加值产品种类更丰富，且不产生废水。三株功能菌株的协同作用使得蛋白质和甲壳素的回收率显著提高，温和的操作条件保留了天然结构和生物活性，避免了腐蚀性试剂的使用。这一集成策略在经济可行性和环境可持续性方面均展现出明显优势，为甲壳类废弃物的循环利用提供了创新性解决方案，对推动水产加工行业的绿色转型和可持续发展具有重要意义。
