《Smart Medicine》：LINC00973/DTX3L Axis Promotes Non-Small Cell Lung Cancer Progression and Serves as a Therapeutic Target
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本研究系统揭示了长链非编码RNA LINC00973在非小细胞肺癌（NSCLC）中的致癌机制，其通过结合E3泛素连接酶DTX3L抑制泛素化降解，激活AKT通路驱动肿瘤恶性进展。研究创新性开发了RGD修饰外泌体递送siRNA及体内自组装外泌体两种靶向治疗策略，为NSCLC精准治疗提供新思路。
1 引言
肺癌是全球癌症相关发病率和死亡率的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的85%。尽管诊断和外科手术技术以及针对最常见驱动突变的药物治疗取得了进展，但NSCLC的死亡率仍然很高，有效的分子治疗靶点在常规临床实践中仍然有限。因此，迫切需要阐明驱动NSCLC进展的潜在分子机制，以确定新的治疗靶点并最终改善治疗结果。
长链非编码RNA（lncRNA）在人类多种生理过程和病理条件中起关键作用。lncRNA通过与核酸和蛋白质相互作用，在转录和转录后水平调节基因表达，从而协调控制基本细胞过程（包括增殖、凋亡和分化）的复杂调控网络。此外，lncRNA可以被包装到外泌体中并在细胞之间转移，使其能够积极参与细胞间通讯，并有助于癌症的发生和进展。lncRNA在NSCLC发生和发展中的多方面作用已变得越来越明显。
近年来，细胞外囊泡作为药物递送的创新平台引起了相当大的兴趣，这主要归功于其优异的生物相容性、固有的细胞靶向特性和有效的载货能力。通过特定的遗传或化学修饰，这些囊泡可以被设计以增强其对靶细胞的识别和结合，同时最大限度地减少对正常组织的脱靶毒性。因此，外泌体代表了癌症治疗中有前途的治疗剂递送系统。然而，基于外泌体的疗法的临床转化仍然面临重大挑战，包括大规模生产的困难、批次间的差异性以及缺乏标准化的监管指南。为了克服这些局限性，最近的研究提出了开发能够有效运输治疗分子的工程化外泌体系统。
2 结果
2.1 LINC00973在NSCLC中上调并与不良预后相关
为了研究lncRNA在NSCLC发病机制中的潜在参与，我们对来自NSCLC患者的配对肿瘤和癌旁组织样本进行了高通量RNA测序。在173个差异表达的lncRNA（倍数变化 > 2且p值 < 0.05）中，与匹配的正常样本相比，NSCLC组织中有84个lncRNA上调，89个lncRNA下调。值得注意的是，LINC00973在初步筛选分析中鉴定出的所有异常表达的lncRNA中表现出最显著的上调，因此被选择进行进一步的功能表征。
我们随后评估了LINC00973在NSCLC细胞系和临床标本中的表达谱。定量分析显示，与人支气管上皮（HBE）细胞相比，NSCLC细胞系A549、H1299和PC9中LINC00973的表达显著升高。一致地，对61对NSCLC肿瘤和癌旁正常组织样本的检查表明，肿瘤组织中的LINC00973表达相对于其相应的正常对应物显著增加。为了确定LINC00973的临床相关性，我们进一步分析了其在NSCLC不同病理阶段的表达。有趣的是，LINC00973的表达水平并未随着肿瘤分期的进展而逐渐增加。
此外，对TCGA数据集的分析证实了LINC00973在NSCLC肿瘤组织中的表达升高，结果与我们的临床队列中获得的结果一致。Kaplan-Meier生存分析进一步证明，LINC00973高表达的患者与表达较低水平的该lncRNA的患者相比，总生存期显著缩短。总之，这些发现表明LINC00973在NSCLC中异常过表达，并且其表达升高与不良临床预后密切相关。
2.2 LINC00973促进NSCLC进展
鉴于LINC00973在肿瘤组织中相对于非肿瘤对应物的显著上调，我们接下来通过功能获得和功能缺失研究来研究其在NSCLC进展中的功能作用。首先通过定量实时PCR（qRT-PCR）证实了LINC00973的有效敲低。功能分析显示，LINC00973沉默显著抑制了NSCLC细胞的增殖和集落形成能力。此外，LINC00973的耗竭显著降低了NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。流式细胞术分析进一步证明，LINC00973敲低诱导G1期细胞周期停滞，伴随S期细胞比例减少，以及凋亡细胞群的显著增加。一致地，LINC00973的抑制导致增殖相关蛋白（包括c-Myc和cyclin D1）以及关键上皮-间质转化（EMT）相关标志物（如N-钙粘蛋白、波形蛋白、Snail、Slug和TGF-β）的表达降低。为了进一步证实LINC00973的致癌作用，通过在PC9细胞中过表达LINC00973进行了功能获得实验。总之，这些发现证明LINC00973作为一种致癌lncRNA，促进NSCLC的恶性进展。
2.3 LINC00973与DTX3L相互作用并激活AKT信号通路
先前的研究表明，lncRNA可以与蛋白质相互作用形成功能性核糖核蛋白复合物，从而调节细胞内信号通路并调控下游基因表达。为了阐明LINC00973促进NSCLC进展的分子机制，首先采用标记RNA亲和纯化（TRAP）策略来鉴定与LINC00973相关的蛋白质。特别是，我们将LINC00973-MS2载体与GST-MS2载体共转染到A549细胞中，并通过GST pull-down结合LC-MS/MS分析获得了LINC00973的潜在结合蛋白。在这些候选物中，由DTX3L和PARP9组成的E3泛素连接酶复合物丰度最高。鉴于DTX3L作为一种在蛋白质周转和信号转导中起关键作用的E3泛素连接酶，并且DTX3L-PARP9复合物作为一个突出的相互作用伴侣出现，因此选择该复合物进行进一步的机制研究。通过TRAP和Western blot分析的进一步验证实验证实，LINC00973与DTX3L蛋白表现出强大的结合能力。此外，RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，在NSCLC细胞中，使用针对DTX3L和PARP9的抗体获得的免疫沉淀物中LINC00973显著富集。此外，免疫荧光染色和细胞分级研究都揭示了LINC00973和DTX3L在NSCLC细胞内的共定位。
为了描述LINC00973调控的信号通路，在LINC00973敲低和相应的对照细胞中进行了RNA测序，然后对基因表达谱进行了聚类和通路分析。比较分析显示，与对照细胞相比，LINC00973耗竭导致677个基因上调和508个基因下调。与这些全局变化一致，几个致癌因子，包括MMP9和VCAM1，在LINC00973缺陷的NSCLC细胞中显著降低。通过qRT-PCR在经受LINC00973敲低或过表达的NSCLC细胞中进一步验证了选定的差异表达基因的表达模式。值得注意的是，在DTX3L耗竭后的NSCLC细胞中观察到了相似的基因表达谱，支持了LINC00973和DTX3L介导的调控网络之间的功能联系。通路富集分析表明，差异表达基因主要富集在癌症相关信号级联中，特别强调AKT信号通路。重要的是，转录组分析将AKT通路确定为LINC00973抑制后受影响最显著的通路之一，突出了其作为下游效应物的潜在作用。这一观察结果得到了先前证明DTX3L在AKT通路调控中起关键作用的报告的支持。基于这些发现，选择AKT信号轴进行进一步验证。Western blot分析显示，LINC00973敲低显著降低了NSCLC细胞中p-AKT的水平，而LINC00973的异位过表达产生了相反的效果。总之，这些结果表明LINC00973在NSCLC细胞中正向调节AKT信号，从而促进肿瘤进展。
2.4 DTX3L调节AKT通路并促进NSCLC进展
为了评估DTX3L在NSCLC中的潜在临床意义，最初使用TCGA数据集分析了其表达。发现DTX3L表达升高与NSCLC患者的不良总生存期相关，表明其作为预后标志物的潜力。我们使用连续患者切片的DTX3L和p-AKT免疫组织化学（IHC）验证了该轴在临床标本中的蛋白质水平相关性。观察到它们的表达水平之间存在强大的正相关。在晚期（III/IV期）与I期肿瘤中，两种标志物阳性细胞的比例也明显增加。基于这种临床相关性，我们进行了功能获得和功能缺失实验来分析DTX3L在NSCLC进展中的生物学作用。DTX3L的敲低有效降低了NSCLC细胞中的mRNA和蛋白质水平。功能分析显示，DTX3L耗竭显著抑制细胞增殖，损害迁移和侵袭，诱导细胞周期停滞，并增加凋亡。此外，DTX3L敲低导致AKT磷酸化水平显著降低。相反，DTX3L的过表达产生相反的效果，增强增殖、迁移、侵袭和AKT信号。为了评估LINC00973和DTX3L在NSCLC进展中的体内相关性，采用了异种移植肿瘤模型。来自用针对LINC00973或DTX3L的siRNA处理的细胞的肿瘤，与对照肿瘤相比，体积和重量均显著减少。IHC分析进一步显示，si-LINC00973和si-DTX3L组肿瘤中Ki-67阳性细胞群减少，表明增殖活性降低。总之，这些结果表明LINC00973和DTX3L都通过调节AKT信号通路在促进NSCLC肿瘤生长中起关键作用。
2.5 LINC00973抑制DTX3L蛋白的泛素化和降解
Western blot分析显示，LINC00973敲低降低了DTX3L蛋白水平，而LINC00973过表达产生相反的效果，但没有显著改变DTX3L mRNA表达。鉴于LINC00973相互作用增加了DTX3L蛋白丰度而没有改变其转录，我们假设LINC00973可能通过抑制其泛素-蛋白酶体途径介导的降解来增强DTX3L稳定性。结果表明，MG-132有效挽救了LINC00973耗竭的NSCLC细胞中的DTX3L蛋白水平，表明LINC00973通过阻止其蛋白酶体降解来稳定DTX3L。为了进一步研究DTX3L稳定的机制，进行了放线菌酮（CHX）追踪实验。LINC00973敲低显著降低了DTX3L蛋白的半衰期，与对照细胞相比，证实LINC00973抑制DTX3L降解。使用PhosphoSitePlus软件的分析鉴定了DTX3L上的多个潜在泛素化位点，表明LINC00973可能调节DTX3L泛素化。与此一致，泛素化分析显示，在共转染泛素并用MG-132处理的NSCLC细胞中，LINC00973耗竭显著增加了泛素化DTX3L蛋白的水平。为了确定DTX3L是否介导LINC00973的致癌作用，进行了拯救实验。在LINC00973耗竭的NSCLC细胞中过表达DTX3L有效恢复了细胞增殖、迁移和侵袭能力。此外，DTX3L过表达拯救了因LINC00973敲低而下调的AKT信号通路关键组分的表达。总之，这些发现表明LINC00973通过抑制泛素化依赖性降解来稳定DTX3L蛋白，从而促进NSCLC进展，从而维持AKT通路激活。
2.6 用于递送LINC00973 siRNA的工程化外泌体抑制NSCLC进展
由于LINC00973在促进NSCLC进展中起关键作用，因此采用基于外泌体的siRNA递送方法来治疗性地靶向该lncRNA。我们通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和Western blot分析检测外泌体标志物，对从HEK293T工具细胞分离的外泌体进行了表征。EX-si-LINC00973在NSCLC细胞中剂量依赖性地抑制LINC00973，伴随DTX3L和p-AKT水平降低，与早期的机制发现一致。随后构建了一个RGD修饰的外泌体平台，命名为RGD-293T-EX-si-LINC00973，以增强LINC00973 siRNA的靶向递送。共聚焦显微镜和流式细胞术分析都证实，与未修饰的外泌体相比，RGD修饰显著改善了NSCLC细胞对外泌体的内化。重要的是，RGD修饰进一步增强了这些抑制效果，导致NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的显著抑制，与对照组相比。随后，在裸鼠中使用皮下肿瘤模型来评估工程化外泌体的抗肿瘤效果，并用IVIS跟踪外泌体的分布。体内研究证实，工程化外泌体在肿瘤部位积累，并且由工程化外泌体递送的siRNA显著抑制了LINC00973表达并抑制了NSCLC生长。Western blot分析进一步证明，RGD-293T-EX-si-LINC00973的应用不仅下调了DTX3L的蛋白质水平，而且损害了AKT信号通路的激活。IHC分析进一步显示Ki-67、DTX3L和p-AKT染色减少，而TUNEL分析表明凋亡肿瘤细胞显著增加。苏木精和伊红（H&E）染色和血清学分析证实工程化外泌体对正常器官的毒性最小。总之，这些结果表明RGD修饰的外泌体可以有效地将siRNA递送到NSCLC细胞中，抑制LINC00973表达，并在临床前模型中发挥显著的抗肿瘤效果。
2.7 体内自组装外泌体中的抗LINC00973 siRNA抑制NSCLC进展
为了进一步增强靶向LINC00973在NSCLC中的治疗潜力，采用合成生物学方法在体内自组装外泌体中生成抗LINC00973 siRNA，如先前研究中建立的那样。抗LINC00973构建体被设计为包括CMV启动子模块、pre-miR-155骨架和抗LINC00973 siRNA编码序列。pre-miR-155框架是一个经过充分表征且广泛用于siRNA合成的载体。在该系统中，抗LINC00973 siRNA序列被插入到pre-miR-155支架的引导链位置。为了最大化功能性引导链的产量，同时最小化不需要的乘客链，采用了CMV驱动的pre-miRNA表达系统。这种方法不仅提高了活性siRNA引导链的产量，而且减少了潜在的脱靶效应，从而提高了治疗构建体的特异性和功效。
在肝脏摄取抗lncRNA构建体后，CMV启动子促进了抗lncRNA siRNA的生成，并驱动siRNA有效载荷释放到分泌性外泌体中。Fu等人先前的研究已经证明了这种合成构建体策略的可行性和功效。基于LINC00973在NSCLC进展中的关键作用，专门设计了一种合成构建体来靶向该lncRNA，其结构设计在支持信息S1：图S11A中说明。还准备了相应的阴性对照构建体（scrRNA）。首先，确定了绝对定量RT-PCR分析的灵敏度，检测抗LINC00973 siRNA的截止循环阈值（Ct）值为35.03。将抗LINC00973 siRNA转染到293T细胞后，通过超速离心收集外泌体。将这些外泌体与A549细胞共孵育导致LINC00973表达显著降低。此外，通过标准曲线的绝对定量证实了分离的外泌体中抗LINC00973 siRNA的显著增加。在体内观察到一致的结果，尾静脉注射抗LINC00973构建体同样导致随后收集的血清外泌体中水平升高。早期的报告表明，自组装质粒主要在尾静脉注射后6小时在小鼠的肝脏、肺、结肠、直肠和肾脏中积累，我们的构建体表现出相似的分布。在我们的研究中，最显著的积累也出现在肝脏中，并且与先前的发现一致，在心脏组织中未检测到信号。
经过四轮治疗后，接受抗LINC00973构建体的小鼠肿瘤与scrRNA组相比，体积和重量均显著减少。相应地，抗LINC00973组肿瘤中LINC00973的mRNA表达以及DTX3L和p-AKT的蛋白质水平相对于对照组显著降低。IHC和TUNEL染色进一步证实抗LINC00973治疗减少了肿瘤细胞增殖并增加了凋亡。此外，抗LINC00973组中DTX3L和p-AKT阳性的肿瘤细胞数量显著减少。此外，抗LINC00973 siRNA组在主要器官的形态和功能上没有明显变化。总之，这些发现表明抗LINC00973构建体可以刺激肝脏产生携带功能性siRNA的外泌体，从而在体内实现有效的全身递送并抑制NSCLC肿瘤生长。
3 讨论
LncRNA越来越被认为是包括癌症在内的各种疾病发展中的关键调节因子。在这项研究中，我们将LINC00973鉴定为NSCLC进展的有效促进因子。LINC00973在NSCLC肿瘤组织中显著过表达，并且表达升高与不良临床结果相关，表明其作为预后生物标志物的潜力。有趣的是，与许多常规生物标志物不同，LINC00973表达与TNM分期无关，表明它反映了内在的肿瘤侵袭性。这一特征可能允许LINC00973在同一病理分期内对患者进行分层，特别是在早期NSCLC中，准确识别具有高复发风险的个体仍然是一个重大的临床挑战。从机制上讲，LINC00973直接与E3泛素连接酶DTX3L相互作用，抑制其泛素化和蛋白酶体降解。DTX3L的这种稳定化激活了AKT信号通路，从而在体外和体内促进NSCLC细胞增殖和转移。基于LINC00973在NSCLC发展中的关键作用，我们开发了两种通过体外将siRNA加载到工程化外泌体中
