《Journal of Dairy Science》：Methodological insights into the isolation efficiency of human milk–derived extracellular vesicles
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本研究系统评估了从人乳中分离细胞外囊泡（EV）的三种常用方法——聚乙二醇（PEG）沉淀、超速离心和膜过滤，以解决在复杂的乳基质中高效获得高纯度和结构完整囊泡的难题。通过对比不同方案的产量、囊泡完整性、纯度等指标，研究发现PEG沉淀与脱蛋白化步骤结合（PEG-DP）可获得高产量囊泡，而100,000 × g的超速离心在维持囊泡形态和标志物表达方面表现更优。该研究结果为优化HMEV的分离方案、推进其在婴儿配方食品等生物活性补充剂领域的应用提供了关键方法学依据。
母乳被誉为新生儿最理想的食物，它不仅提供生长发育必需的脂肪、蛋白质和碳水化合物，还携带着多种生物活性成分，其中就包括一种被称为细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）的微小囊泡。这些纳米级的“包裹”内部装载了丰富的蛋白质、microRNA和脂质等物质，能够帮助调节婴儿的免疫反应、促进胃肠道成熟，甚至对神经发育有积极贡献，因而被视为是母乳具有健康益处的重要原因之一。特别是对于早产儿，有研究表明人乳来源的细胞外囊泡（Human milk-derived extracellular vesicles, HMEV）能够帮助增强肠道上皮屏障，降低坏死性小肠结肠炎的风险。因此，科研人员设想，如果能从母乳中高效地获取这些功能强大的囊泡，并将其作为功能性成分添加到婴儿配方食品中，或许能填补母乳与配方奶之间的“生物活性”鸿沟，为更多婴儿带来健康福音。
然而，美好的设想面临着现实的挑战。牛奶的组成极为复杂，含有高浓度的脂质、蛋白质等大分子，这给从中分离出纯净、结构完整的囊泡带来了巨大困难。现有的分离方法，如被视为“金标准”的超速离心法，虽然纯度高，但耗时耗力，且有损伤囊泡的风险；而像聚乙二醇沉淀这类更简便的方法，又常常因为会连带沉淀出其他杂质而饱受诟病。究竟哪种方法能在获得高产量的同时，又能保证囊泡的完好无损和高度纯净？这正是当前HMEV研究和应用转化的关键瓶颈。为了回答这些问题，来自格但斯克理工大学的研究团队在《Journal of Dairy Science》上发表了一项研究，他们系统比较了不同分离方法的优劣，以期为后续研究和应用找到最合适的方案。
为了系统评估，研究人员采用了三种主流的分离方法：聚乙二醇沉淀、超速离心以及膜过滤，并将这些方法应用于同一供体的人乳样本，以排除样本个体差异带来的影响。在分离前，所有样品都统一经过去除细胞、脂肪和蛋白质的预纯化处理。获取的囊泡样本则遵循国际标准（MISEV2023指南），通过纳米颗粒追踪分析评估大小和浓度，利用流式细胞术和共聚焦显微镜检查膜完整性，并通过蛋白质印迹法检测囊泡标志物，以全面评估各种方法的综合性能。
Particle Size Distribution Determined by NTA
通过纳米颗粒追踪分析，研究人员发现不同分离方法得到的囊泡平均直径存在差异。膜过滤法（MF）得到的颗粒平均直径最大，介于160至170纳米之间。而超速离心法，无论是70,000 × g（UC70）还是100,000 × g（UC100）的条件，得到的颗粒直径更小，分别约为130纳米和140纳米。PEG沉淀法得到的囊泡平均尺寸与超速离心法相似，大约在135至140纳米之间。这表明显著的粒径差异主要存在于MF/PEG-DP和MF/UC70之间，过滤法可能一并捕获了更大的颗粒或聚集物。
Particle Concentration Determined Using NTA and Flow Cytometry
在粒子浓度方面，PEG沉淀法展现出显著优势。特别是未进行脱蛋白处理的PEG-D法，其产量最高，超过了1.42 × 1012颗粒/毫升。而进行了脱蛋白处理的PEG-DP法产量也很高，仅次于PEG-D。膜过滤法同样收获了可观的产量。相比之下，各种条件的超速离心法产量最低，仅为PEG沉淀法的大约百分之一。这表明，在追求高产量的目标下，PEG沉淀法优势明显。
Membrane Integrity of HMEV Assessed by Flow Cytometry
利用MEMGlow染料进行的流式细胞术分析，评估了囊泡膜的完整性。结果显示，所有方法都能分离出具有完整膜结构的囊泡。但值得注意的是，仅去除了脂肪的PEG-D样品荧光信号分布较宽，且呈现出双峰，这提示样本中可能混杂了囊泡和乳蛋白聚集体。而经过了完整预纯化（脱脂+脱蛋白）处理的样品，其荧光信号更均一，表明样品更纯净。其中，经过三次超速离心的UC100 × 3样品显示出最强烈的荧光信号，表明其囊泡膜完整性高，样本也相对均一。
HMEV Morphology and Integrity Determined by Confocal Microscopy
共聚焦显微镜观察直观地展示了不同方法对囊泡形态和结构的影响。经过完整预纯化的PEG-DP法得到的囊泡形态圆整、结构紧凑，膜染色均匀，表现出良好的结构完整性。相比之下，未脱蛋白的PEG-D法得到的囊泡形态不规则，膜染色不均。膜过滤法得到的囊泡形状不规则，且存在聚集体，分离特异性较低。在超速离心中，UC100得到的囊泡形态最佳，呈规则的球形，而UC70得到的囊泡形态不均一，部分有变形。值得注意的是，虽然UC100 × 3的纯度高，但囊泡出现了扁平化和不规则的轮廓，说明重复的离心步骤可能对囊泡造成了机械损伤。
Western Blotting
最后，蛋白质印迹分析检测了囊泡的标志物和污染物。内质网污染标志物Calnexin在未处理的乳样、膜过滤法和PEG-D法中都有明显检出，但在PEG-DP和UC100 × 3中信号很弱，这表明后两种方法能有效去除细胞污染物。而囊泡的阳性标志物HSP70、TSG101和CD9在所有分离样品中均有检出，表明这些方法都能成功分离出真正的囊泡。
这项研究的结论明确指出，没有一种方法是完美的，选择取决于研究或应用的具体目标。聚乙二醇沉淀法（特别是结合了脱蛋白步骤的PEG-DP方案）是速度、简便性、高产量和良好纯度之间的理想平衡点，尤其适合需要大量囊泡的场合。然而，简化版的PEG-D方案虽然产量最高，但会牺牲纯度，导致样本不均一。单次100,000 × g的超速离心法则在囊泡结构完整性和高纯度之间取得了良好的折中，是获得高质量囊泡的可靠选择。而多次超速离心虽然能最大化去除杂质，获得最高纯度，但也对囊泡形态造成了可观察到的损伤，因此更适合对纯度要求极端严苛、而对囊泡形态完整性要求相对宽松的下游分析。相比之下，膜过滤法虽然操作简单，但其在纯度和特异性上的缺陷使其不适合用于复杂生物流体中获取高质量囊泡。
这项研究的重要意义在于，它首次系统地量化比较了不同方法分离人乳囊泡时的“得”与“失”，为研究者提供了一个清晰的决策路线图。无论是探索囊泡的基础生物学功能，还是评估其作为婴儿配方食品添加剂的潜力，都需要根据具体目标来权衡产量、纯度、完整性以及操作的便捷性。该研究的发现强调了样本预纯化步骤对于最终分离质量的关键作用，并为未来开展更大规模、多供体的研究以验证方法的普适性奠定了基础。随着方法的不断优化和标准化，人乳细胞外囊泡有望从实验室走向更广阔的营养与医学应用，真正发挥其作为“自然馈赠”的价值。
