《Sustainable Food Technology》：Microwave-assisted extraction as a fast and sustainable approach for the recovery of caffeine and chlorogenic acids from coffee silverskin: evaluation of operating conditions and comparison with conventional extraction
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本综述系统评估了微波辅助提取（MAE）从咖啡烘焙主要副产品咖啡银皮中回收咖啡因和绿原酸（CGAs）的工艺条件，并与传统提取法对比。研究表明，MAE在80°C、5分钟、仅用水为溶剂的条件下能显著提高CGA得率，且耗时更短、更环保，为咖啡副产物高值化利用及咖啡烘焙业的可持续发展提供了创新方案。
引言
咖啡产业是全球最大的农业食品价值链之一，随之而来的是从生产到消费过程中产生大量副产品。每吨烘焙咖啡约产生7.5公斤咖啡银皮，成为咖啡烘焙行业的主要副产物。尽管咖啡银皮常被丢弃或用作引火物、肥料和动物饲料，但其富含膳食纤维、蛋白质和生物活性化合物，如类黑精、维生素、矿物质、咖啡因和多酚化合物，具有巨大的增值潜力。特别是绿原酸（CGAs）是此副产物中的主要多酚类物质。这类化合物由反式肉桂酸与奎尼酸酯化形成，主要包括咖啡酰奎尼酸（CQAs）、阿魏酰奎尼酸（FQAs）和对香豆酰奎尼酸（CoQAs）。其中，5-咖啡酰奎尼酸（5-CQA）是咖啡银皮中最丰富的CGA，因其潜在的健康促进特性而被广泛研究，在食品、制药和化妆品行业有广泛应用。同时，从咖啡副产物中回收这些化合物为咖啡烘焙公司在循环经济框架内提供了可持续的解决方案。已报道的健康益处包括预防心血管疾病、2型糖尿病和其他代谢紊乱，以及抗氧化、抗炎、益生元、肝保护、神经保护和抗癌作用。这些益处不仅与CGAs密切相关，还与咖啡因有关，两者可能协同作用，因此从咖啡银皮中提取这些化合物的兴趣日益增加。
从植物基质中回收生物活性化合物取决于多种因素，如样品的物理特性、所用溶剂类型、提取温度和时间、固液比以及所采用的方法。传统提取方法因其高效和易于操作而被广泛使用，但它们耗溶剂、耗时、耗能，且通常需要使用有机溶剂，这些溶剂需要进一步去除，使得这些技术既不经济也不环保。因此，科学界越来越关注研究和实施替代方法，这些方法在保持高效和用户友好的同时，更加经济、快速和可持续。在此背景下，微波辅助提取（MAE）和超声波辅助提取（UAE）作为创新和环保的替代方案出现，能够在显著更短的时间内高效回收生物活性化合物，并减少使用水等无毒溶剂。事实上，我们研究小组之前的研究表明，与使用水乙醇溶剂的传统固液提取法相比，UAE能够在更短的时间内从咖啡银皮中更高产率地提取抗氧化化合物，且仅使用水作为提取介质。此外，该方法可扩展，使其成为工业层面可持续增值咖啡银皮的有前景的方法。
如上所述，MAE是另一种适用于从天然基质中提取生物活性成分的现代绿色技术。它通过施加微波频率范围内的电磁辐射来运作，通过离子传导和偶极旋转两种机制诱导加热。这增加了植物细胞内的内部压力并导致细胞破裂，从而促进目标化合物释放到提取溶剂中。MAE的主要优势之一是其提取时间显著短于传统方法。快速均匀的加热确保高效回收化合物，同时最大限度地减少热敏化合物的降解并防止样品氧化。此外，MAE提供高提取率、良好的重现性，并且需要更少的溶剂，使其成为一个更生态、高效和成本效益高的过程。一些研究调查了通过MAE从咖啡银皮中提取化合物。例如，有报道使用乙醇和丁二醇提取咖啡因、CGA及其他酚类和生物碱化合物。此外，微波辅助碱性和碱性-酸提取方法已被用于提取蛋白质。除了这些基于溶剂的方法，水也被用作提取介质从该副产物中回收膳食纤维和蛋白质。
据我们所知，尚无研究评估单独使用水通过MAE从咖啡银皮中提取咖啡因和CGAs。因此，本研究旨在通过测试不同的提取温度和时间，评估MAE从咖啡银皮中回收咖啡因和CGAs的效果，并仅使用水作为提取介质。同时，在不同条件下制备传统提取物，并选择最有效的提取物与MAE提取物进行比较。还探讨了研磨程度对生物活性化合物提取的影响。
实验部分
试剂与标准品：咖啡因、5-咖啡酰奎尼酸（5-CQA）、4-CQA、3-CQA、5-阿魏酰奎尼酸（5-FQA）和4-FQA标准品购自Sigma-Aldrich。冰醋酸来自VWR Chemicals。HPLC级甲醇和绝对乙醇购自Honeywell。超纯水来自Direct-Pure UP超纯和RO实验室水系统。
样品：咖啡银皮由JMV – José Maria Vieira, S.A.友好提供，来自工业咖啡批次烘焙后产生，由约40%阿拉比卡咖啡和约60%罗布斯塔咖啡混合而成。样品在接收后于室温（21°C）避光干燥处储存。在制备提取物前，样品使用Grindomix GM 200均质化并以10,000 rpm研磨20秒。为确定粒径对生物活性化合物提取的影响，使用新批次的咖啡银皮进行了单独实验。样品G1采用上述相同研磨程序制备。样品G2则经历更强烈的研磨过程，包括三个连续的20秒周期（10,000 rpm），周期间短暂暂停以防止过热和可能的化合物降解。
传统提取：选择了不同的提取条件以模拟文献中报道的一系列经典提取参数，从而能够比较使用不同溶剂、温度和提取时间的提取效率。提取条件总结于表1。在室温下制备的提取物根据Machado等人的方法略有修改进行。在40°C和60°C下的提取根据Costa等人先前优化的方法略有修改进行。所有提取物的等分试样在制备后立即通过色谱法进行分析。所有提取均进行三次。
微波辅助提取（MAE）：使用CEM Discover SP?微波合成仪进行微波辅助水热提取。采用与传统提取相同的样品与溶剂比例以确保方法间的直接可比性。微波功率设定为300 W，对应设备的最大功率输出。MAE条件的评估采用顺序单因素轮换法进行，其中提取温度和提取时间独立变化，以评估它们对咖啡因和CGA得率的个体影响。实验过程分两步进行。首先，在固定提取时间10分钟下改变提取温度。使用的温度范围旨在检测CGA和咖啡因的最大提取得率。在确定最佳提取温度（80°C）后，在保持温度恒定的情况下改变提取时间。每个提取物的等分试样在制备后立即通过色谱法进行分析。所有提取均进行三次。
通过RP-HPLC-DAD测定咖啡因含量和CGA谱图：对于色谱分析，所有提取物等分试样首先在13,000 rpm下离心10分钟，然后转移到进样小瓶中。分析使用集成HPLC系统进行，如前所述。化合物分离在反相Zorbax-SB-C18柱上实现。流动相由0.5%乙酸和甲醇组成，应用特定梯度。咖啡因和CGA分别在274 nm和320 nm下检测。通过比较保留时间、洗脱顺序和紫外吸收光谱与真实标准品进行化合物鉴定。结果以每100克干重样品中化合物的毫克数表示。
统计分析：使用IBM SPSS 30进行统计分析。采用单因素ANOVA评估样品间的显著差异，随后使用Tukey's HSD事后检验进行多重比较。结果在p < 0.05时被认为具有统计学显著性，并以平均值±标准差表示。
结果与讨论
传统提取物的比较：首先比较了使用不同溶剂、温度和提取时间制备的传统提取物的咖啡因和CGA含量，以选择最佳条件与MAE进行比较。结果表明，正如预期，所用溶剂类型显著影响咖啡因含量，因为仅有的两种水乙醇提取物（A和D）的咖啡因含量显著高于水提取物。关于CGA含量，对于5-CQA也观察到类似结果，但对于5-FQA和4-FQA，结果相反，即水提取物B和C的这两种化合物合并含量显著高于相应的水乙醇提取物A和D。这些结果实际上出乎意料，因为FQA由于存在甲氧基而往往比CQA更疏水。此外，当比较经历单次60分钟提取的提取物与经历两次额外30分钟再提取循环的提取物时，再提取过程似乎对咖啡因提取没有优势，因为A和B提取物的组成与相应的无再提取提取物相似。对于FQA也注意到类似发现。然而，再提取似乎显著影响了CQA含量，因为A和B的组成通常显著高于相应的无再提取提取物。关于温度因素，比较了在类似条件下制备但在三种不同温度下的三种提取物。咖啡因含量不受测试温度的影响。另一方面，温度显著影响CGA的提取：在60°C和室温下制备的提取物产生的5-CQA、4-CQA和3-CQA量显著高于40°C下获得的量。关于5-FQA和4-FQA合并异构体，最佳提取温度为60°C。因此，总体而言，60°C的提取允许更高的CGA回收率。考虑到MAE制备的提取物旨在减少提取时间并使用环保溶剂，进行了两次额外的传统提取，使用两种不同温度，仅用水作为溶剂提取10分钟，以便与在类似条件下但不同提取时间制备的传统提取物以及微波辅助提取物进行比较。结果表明，咖啡因和CGA含量不受提取时间影响，因为120分钟获得的量与10分钟获得的量相似。然而，与上述观察相反，对于较短的提取时间，温度显著影响咖啡因、5-CQA和FQA的提取，因为60°C提取10分钟的这些化合物量显著高于40°C提取。总体而言，咖啡因提取主要受溶剂类型影响，而溶剂和温度似乎是影响CGA提取的最主要因素。实际上，提取物A的CGA含量最高，其次是G、B和H。此外，A的咖啡因含量也最高。基于这些成果，特意选择提取物A作为参考提取物，与本研究核心关注的MAE提取物进行比较。
微波辅助提取（MAE）条件的评估：如引言所述，本研究旨在评估使用安全可持续溶剂从咖啡银皮中提取咖啡因和CGA的MAE条件。提取温度和时间在固定微波功率300 W下变化。选择此设置是为了确保从微波场到溶剂的有效能量转移，实现快速均匀加热，并促进溶剂有效渗透到咖啡银皮的致密植物基质中。固定300 W还保证了所有试验中一致的能量输入，这对于重现性和方法标准化至关重要。温度是评估从咖啡银皮中通过MAE提取咖啡因和CGA的第一个参数。表2展示了在40°C至170°C不同温度下获得的咖啡因和CGA含量。咖啡因含量在测试温度下相对相似，这表明其在水中的可提取性和热稳定性。从130°C开始，观察到显著差异，该化合物的提取效果更好，在150°C时增加。考虑到这些结果，并为了确定咖啡因的最大提取得率，随后进行了170°C的进一步提取。发现咖啡因量显著下降，表明在此温度下发生降解。因此，咖啡因提取的最大峰值出现在150°C。关于CGA含量，在高达110°C的温度下获得的主要化合物是5-CQA，这与文献数据一致。此外，尽管不可能分离5-FQA和4-FQA，但预计5-FQA的含量高于4-FQA。然而，随着温度升高，主要CGA（5-CQA）的量减少，同时其相应异构体（3-CQA和4-CQA）的量增加，这表明5-CQA转化为其异构体。考虑到所有CGA的总和，提取更多CGA的温度是110°C，其次是90°C和80°C。然而，尽管三种异构体在体外具有相似的生物效应，但文献记载3-CQA和4-CQA稳定性较差，并且生物利用度低于5-CQA。因此，当旨在获得用于功能性食品或制药领域潜在应用的提取物时，保持5-CQA尤为重要。因此，考虑到5-CQA在90°C和110°C下含量较小，80°C被认为是提取所有CGA的合适温度，且没有潜在的化合物异构化和降解，因此选择此温度进行后续时间对MAE影响评估。此外，有趣的是，尽管文献记载CGAs是热敏性的，但这些结果表明它们在相对较高的温度下，即接近水沸点的温度下提取效果更好，这可以通过加热破坏细胞膜，促进膜结合植物化学物质释放来解释。特别是在MAE过程中，分子通过离子传导和偶极旋转机制加热，导致细胞壁破裂，从而释放生物活性化合物。尽管在110°C以上，所有CGA含量开始下降，表明其降解。总体而言，考虑到不同温度下CGA和咖啡因的含量，并着眼于工业背景，建议MAE不应在高温下使用，以避免咖啡银皮中感兴趣生物活性化合物的潜在降解。此外，将这些提取物与使用相同提取时间和仅用水作为溶剂制备的传统提取物进行比较，可以注意到MAE在所有测试温度下通常允许更高的CGA提取量。因此，这表明MAE有巨大潜力作为传统提取方法的替代方案。
MAE的主要公认优势之一是其提取时间比传统方法短。因此，在本研究中，使用选定的最佳提取温度测试并比较了七种不同的提取时间。表3展示了在80°C下不同时间获得的咖啡因和CGA含量。咖啡因提取在不同时间下非常相似，这再次表明其稳定性。然而，与不同温度下观察到的相反，咖啡因浓度随时间没有增加。因此，MAE咖啡因提取显示依赖于提取温度，但不依赖于提取时间。关于CGA含量，最佳提取时间显然是5分钟，因为MW5′提取物呈现主要CGA的最高含量和总CGA的最高水平。正如温度所观察到的，增加提取时间似乎促进了主要CGA向其异构体的异构化，因为5-CQA的减少开始伴随3-CQA和4-CQA的增加。然而，这种现象在温度因素下更为明显。此外，在较长的提取时间下，微量CGA的量显著高于其他提取时间。此外，这些时间点的总CGA量与最佳提取时间获得的总量相似，且高于10、20和30分钟获得的量。这可能表明，除了5-CQA的异构化导致微量化合物随时间增加外，更长的提取时间也导致了这些微量化合物的更大提取，解释了60和90分钟总CGA量高于10、20和30分钟的原因。考虑到CGA的比例，也注意到了有趣的发现：提取时间高达10分钟时，CGA的比例相当相似，但从20分钟提取开始，它们开始变化，5-CQA减少，3-CQA和4-CQA增加。因此，在80°C下，5-CQA的异构化和降解可能在提取20分钟后开始变得更加明显。总体而言，CGA提取显著受时间影响：最佳得率在5分钟实现，更长的提取时间对CGA含量产生负面影响。事实上，多项研究表明，长提取时间可能导致酚类化合物降解。更具体地说，一些研究报道了通过MAE在5分钟提取时总酚含量、CGA和咖啡因的最大提取得率，并且据报道，超过10-15分钟的提取时间不会导致更高的总酚含量，反而会减少，这在本研究CGA含量中也观察到。这些发现可以通过MAE实现的快速加热和植物细胞结构破坏来解释，这允许在更短的时间内有效提取化合物。
最佳提取条件的比较：将先前部分选择的最佳提取条件进行比较。显然，传统提取比MAE提取物提取了几乎多一倍的咖啡因，这与使用的溶剂有关，即水乙醇溶剂比MAE中使用的水能更好地提取咖啡因，这在比较不同传统提取物时也观察到。事实上，MAE获得的提取物提取的咖啡因量与通过传统方法制备的水提取物相似，表明咖啡因提取主要依赖于溶剂类型，而不是温度、提取时间或所选提取方法等其他因素。另一方面，关于CGA，MW5′提取物呈现最佳的CGA量，并且总体而言，MAE呈现显著优于传统提取的CGA提取性能。考虑到为工业寻找更可持续的替代方案以经济且省时的方式从咖啡副产物中回收生物活性化合物的目标，MAE被证明是一个可行的选择，因为它允许使用绿色溶剂在显著更快的时间内从咖啡银皮中回收适量的咖啡因和CGA。事实上，MAE已应用于食品行业，因此在咖啡行业中的应用是可能的，不仅可以为咖啡副产物增值，还可以使该行业的利益相关者受益。
研磨程度对生物活性化合物提取的影响：考虑到先前获得的结果，我们发现MW80和MW10′在相同MAE条件下制备，但在咖啡因和CGA含量上存在细微差异，特别是咖啡因和5-CQA水平，这起初是意想不到的。这些差异可能由样品来源于包含阿拉比卡和罗布斯塔的咖啡混合物导致，这意味着我们样品中每个物种的确切百分比并不完全已知，因此，即使在提取物制备前尽可能均质化样品，用于制备MW80提取物的样品部分可能含有更多阿拉比卡，导致提取物中咖啡因和5-CQA量较小。此外，研磨细度的差异也可能影响观察到的变异性。如上所述，尽管在提取前仔细均质化样品，但粒径变化不能排除，因为在提取前没有进行额外的筛分步骤。因此，考虑到粒径直接影响与溶剂的接触表面积，这种异质性可能影响提取效率，导致观察到的咖啡因和5-CQA含量差异。因此，我们进一步决定研究该因素对从银皮中提取咖啡因和CGA的影响。由于在这些实验结束时样品不足，同一咖啡行业提供了新的咖啡银皮样品进行这项新的平行和后验研究。该咖啡银皮样品来自根据行业当时商业烘焙可用的新批次。接收后，对其进行两种不同研磨程度处理，并首先使用不同孔径的筛子进行粒度分析。粒度分析结果显示，G1样品呈现更异质的特征，而G2样品约67%的孔径小于或等于90 μm，表明更均质的特征。这些结果有趣，可能有助于解释MW80和MW10′之间的差异：由于制备这些提取物使用的研磨程度呈现相当异质的孔径，每个孔径与溶剂的接触表面积不同，因此，在每次提取中，孔径的均质性无法保证，导致不同程度的提取。因此，样品的混合组成和研磨孔径的异质性可能解释了在相同条件下制备的提取物之间的差异。在粒度测试后，使用先前选择的最佳传统提取条件和最佳MAE条件制备不同研磨样品的提取物。四种不同提取物的咖啡因和CGA含量结果显示，研磨程度不影响咖啡因含量，因为在传统提取物和微波辅助提取物之间未观察到显著差异。然而，对于CGA，增加研磨程度对CGA提取产生积极影响，因为C.G2和MW.G2通常比相应的同源提取物具有更高的CGA量，这可以通过G2颗粒与所用溶剂的更高接触表面积来解释，允许更大的生物活性化合物提取。因此，这些结果表明，在未来研究中，分级研磨样品以获得最高可能百分比相同孔径的颗粒非常重要，这不仅确保更大的样品均质性，还确保更大的化合物提取。
结论
本研究证明了MAE作为从咖啡银皮中回收生物活性化合物的高效、省时和环保的传统提取方法替代方案的潜力。与使用不同溶剂、温度和提取时间的传统提取方法相比，MAE在显著更短的时间内仅使用水作为溶剂提供了更高的CGA得率，这从环境和工业角度代表了明显优势。
更具体地说，最佳传统提取条件与MAE的比较显示，尽管传统水乙醇提取实现了更高的咖啡因含量，但MAE特别有利于CGA的回收。此外，在MAE研究中，发现咖啡因提取在不同测试温度下稳定，而CGA提取在中等高温下更有利，5-CQA在80°C下能更好地保存。更高温度导致5-CQA得率降低及其异构体量增加，表明异构化和降解。此外，CGA的最佳提取时间为5分钟，从而突出了MAE提取时间短的巨大优势。
此外，研究还发现研磨程度影响CGA的提取，更细的研磨增强了这些生物活性化合物的回收。
总体而言，本研究展示了一种新颖且与工业相关的方法，用于咖啡烘焙行业，表明水基MAE是一种快速、高效和环保的策略，用于增值咖啡银皮这一咖啡烘焙的主要副产物。独家使用水作为提取溶剂，加上短提取时间，使该技术特别适用于食品和制药行业的大规模应用，同时也有助于咖啡烘焙
