《Journal of Molecular Biology》：CEP290 is associated with chromatin accessibility of hepatitis B virus cccDNA
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双链断裂修复中剪接因子SFPQ通过稳定RAD51家族mRNA间接调控同源重组修复，而非直接结合DSB或RAD51蛋白。研究发现SFPQ缺失导致HR缺陷，且其作用独立于p53激活和DNA损伤诱导。
Sofia Gotthold|Keile R. Hansen|Andrew N. Brown|Soham P. Chowdhury|Christine M. Joyce|Viraj Vinish|Sofie I. Rodriguez|Sambhav Jain|Hannah I. Ghasemi|Amanda C. Yoon|Julien Bacal|Meghan A. Morrissey|Brooke M. Gardner|Chris D. Richardson
加州大学圣塔芭芭拉分校定量生物科学跨学科项目，美国加利福尼亚州93106
摘要
双链断裂（DSB）的修复通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来实现。为了识别影响DSB修复结果的非经典因素，我们分析了来自汇总的遗传筛选数据。通过这种方法，我们发现了剪接因子SFPQ，该因子此前已被报道与DSB相关并促进修复。在这里，我们表明SFPQ的缺失会通过HR改变DSB的修复过程。然而，与其他已发表的研究结果不同，我们发现SFPQ并不定位于DSB位点，而是独立于p53激活或DNA损伤来稳定RAD51及其同源物的表达。我们的发现表明，SFPQ通过维持RAD51同源物mRNA的稳定性来促进DSB的修复，而不是通过与DSB或RAD51蛋白的直接相互作用。最终，我们的结果强调了RNA结合蛋白影响基因组稳定性的间接机制。
引言
细胞保持基因组完整性的能力对于细胞稳态至关重要。未能正确修复DNA损伤可能导致染色体不稳定、突变、细胞死亡或异常生长1, 2, 3, 4。其中最具破坏性的DNA损伤形式是双链断裂（DSB），这些断裂既可能由外源性因素（如电离辐射）引起，也可能由内源性过程（如转录、复制压力和氧化代谢）引起5, 6。由于未修复或修复不当的DSB可能导致疾病或死亡，细胞进化出了强大的DSB修复机制，主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）两条修复途径。DSB修复途径的选择受到严格调控：在发生DSB时，修复过程会定向为NHEJ或HR 1, 7。NHEJ通过将DNA分子的两端连接起来来修复DSB，这可能导致序列的插入或删除，或者染色体易位[8]。这种修复过程主要发生在细胞周期的G1期。相比之下，HR利用姐妹染色单体或外源同源DNA分子作为模板来精确恢复断裂的DNA序列，因此HR主要发生在S期或G2期1, 7, 9。
这两种途径之间的关键决策点可能受到5′端DSB切除的影响，切除使得RAD51能够加载到暴露的单链DNA（ssDNA）上。这些过程将DSB处的双链DNA（dsDNA）转化为ssDNA核蛋白纤维，从而促进HR过程中的同源性搜索和链侵入4, 6, 11。切除和RAD51的加载也阻止了NHEJ的发生，因为连接酶LIG4需要dsDNA作为模板。NHEJ和HR的核心事件已在体外得到充分研究。然而，对DSB修复所需因子的筛选可以发现一些在这些过程中没有已知催化作用的因子。其中一些未被充分研究的因子可能在DSB修复中发挥实际作用。例如，RAD51的同源物RAD51B、RAD51C、RAD51D、XRCC2和XRCC3能够促进RAD51纤维的组装和稳定[12]。编码RAD51B、RAD51C和RAD51D的基因突变与卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌有关13, 14, 15。
在这项研究中，我们发现多功能RNA结合蛋白Splicing Factor Proline and Glutamine rich（SFPQ）是HR修复的调节因子。SFPQ也被称为PSF，它参与多种RNA代谢过程，包括剪接、转录调控、R-loop解体和RNA运输16, 17, 18, 19。SFPQ是paraspeckles的核心成分，paraspeckles是亚核凝集体，在病毒感染、癌症、发育和神经退行性疾病中调节应激反应[20]。重要的是，SFPQ的功能障碍与多种癌症（包括卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌）以及神经退行性疾病（如ALS和额颞叶痴呆）有关16, 21, 22, 23, 24, 25。先前已有研究表明SFPQ通过体外与RAD51蛋白的相互作用以及与激光微照射诱导的DNA损伤区域的共定位与DSB修复相关[26, 28]。生化研究表明SFPQ还参与HR过程中的链侵入，通过体外实验验证了SFPQ与RAD51的直接结合及其对RAD51链交换活性的调控[29]。在这里，我们报告称SFPQ的缺失显著抑制了重组过程，其效果类似于RAD51的缺失。尽管其他研究也报道过SFPQ的这种重组抑制作用[30]，但与之前的研究不同，我们观察到SFPQ并不定位于DSB位点。相反，我们的数据表明SFPQ的缺失降低了RAD51及其同源物的表达。此外，这种效应独立于p53的激活，并且不需要DNA损伤的诱导。总体而言，我们认为SFPQ通过结合并稳定RAD51家族mRNA间接促进HR。我们的发现强调了转录后调控在DSB修复中的重要性，并揭示了SFPQ在通过稳定编码HR因子的mRNA来维持基因组完整性方面的新作用。
章节摘录
SFPQ缺失影响基因编辑结果
我们重新分析了汇总的CRISPRi筛选数据，以识别调控HR的因素31, 32。在使用ssDNA或dsDNA作为模板的筛选中，SFPQ对于HR是必需的。此外，在一项旨在识别能够存活于Cas9诱导的DSB的基因的筛选中，SFPQ是主要候选因子（图1A和1B）。先前的研究已经发现SFPQ定位于DSB损伤位点并促进HR，尽管其具体机制尚不清楚30, 33。为了进一步验证
讨论
在这项研究中，我们确定RNA结合蛋白SFPQ是通过一种以RNA为中心的机制来调控HR的关键因子，该机制不涉及SFPQ直接定位到DSB位点。在多种实验中，SFPQ的缺失降低了RAD51蛋白水平，其抑制HR的程度与RAD51缺失相当（图S2C），这支持了SFPQ通过维持RAD51同源物的表达来促进重组的模型。这些发现进一步证明了RNA结合蛋白（RBPs）在基因组修复中的重要作用
细胞系和培养
DIvA AsiSI-ER-U2OS细胞（雌性；由法国图卢兹综合生物学中心的Ga?lle Legube实验室提供）在含有10%胎牛血清（FBS；R&D Systems，Cat#S11550）和1%青霉素-链霉素（P/S；Gibco，Cat#15140122）的DMEM GlutaMAX培养基中培养。K-562细胞（雌性；ATCC）在含有10% FBS和1% P/S的RPMI 1640培养基（Gibco，Cat#72400120）中培养。U2OS DR-GFP细胞（雌性；由美国加利福尼亚州Duarte的Jeremy Stark实验室提供
资金来源
C.D. Richardson感谢美国国家科学基金会（CAREER MCB2443118）和美国国家通用医学科学研究所（GM142975）的资助。B.M. Gardner感谢美国国立卫生研究院（K99/R00GM121880、R35GM146784）和Searle学者计划的支持。M.A. Morrissey感谢美国国家通用医学科学研究所（GM146935）的资助。S. Gotthold感谢Andy和Mary Weinberg本科项目的支持
撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。
Keile R. Hansen：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验研究、概念构建。
Andrew N. Brown：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验研究、概念构建。
Soham P. Chowdhury：撰写 – 审稿与编辑、实验研究、数据分析、概念构建。
Christine M. Joyce：撰写 – 审稿与编辑
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。
致谢
我们感谢法国图卢兹综合生物学中心的Ga?lle Legube提供DIvA AsiSI-ER-U2OS细胞，以及美国加利福尼亚州Duarte的Jeremy Stark提供U2OS DR-GFP细胞。同时，我们也感谢Gardner和Richardson实验室成员对这项工作的宝贵反馈。此外，我们还要感谢Jennifer Smith博士慷慨提供显微镜资源，这些资源对这项研究至关重要。
