小鼠骨骼肌中钙动态的性别依赖性：对冷却和咖啡因的反应

《Journal of Theoretical Biology》：Sex-Dependent Calcium Dynamics in Mouse Skeletal Muscle: Responses to Cooling and Caffeine

本研究通过小鼠在体Fura-2生物成像技术，探究冷却和咖啡因刺激对男女不同肌纤维类型（慢肌soleus与快肌plantaris）钙离子浓度动态的影响。结果显示：冷却诱导钙离子浓度上升的阈值在慢肌显著高于快肌，但男女间无差异；高浓度咖啡因（80 mM）刺激下，女性肌肉钙离子浓度增幅显著高于男性；冷却与低浓度咖啡因（1.25 mM）的协同效应在女性中尤为明显，且咖啡因诱导的Ryanodine受体磷酸化响应存在性别差异。研究证实性别对咖啡因介导的钙释放调控具有特异性作用。

　　

林川康诚|高木亮|田口彩香|宇川春香|渡边大贵|星野大辅|大卫·C·普尔|金野雄隆

日本东京电气通信大学信息与工程学院研究生院

摘要

骨骼肌中的细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]i）的调节可能因性别和肌纤维类型而异，但其对温度变化和药物咖啡因刺激的反应机制尚未完全明了。本研究旨在阐明肌肉冷却、咖啡因刺激及其联合效应的性别依赖性和肌纤维类型特异性特征。我们分别研究了冷却（30°C至0°C）和咖啡因刺激（1.25–80 mM）对雄性和雌性C57BL/6J小鼠快肌（比目鱼肌，PLA）和慢肌（比目鱼肌，SOL）的影响，并探讨了它们的联合效应。在异氟醚麻醉条件下，使用Fura-2生物成像技术分析了[Ca²⁺]i的变化情况。结果显示，SOL肌肉中[Ca²⁺]i积累的温度阈值显著高于PLA肌肉，且性别之间无显著差异（雄性：PLA 2.3±0.9°C，SOL 4.5±2.2°C；雌性：PLA 2.3±0.8°C，SOL 4.3±1.3°C）。相反，在高浓度（80 mM）咖啡因刺激下，雌性的[Ca²⁺]i反应显著强于雄性。此外，冷却和咖啡因的联合刺激对雌性的影响大于雄性。研究还发现，雌性中Ryanodine受体的磷酸化反应显著强于雄性。总之，虽然冷却对[Ca²⁺]i的反应在性别上没有差异，但对咖啡因的反应存在明显的性别依赖性差异（雄性< />

引言

在骨骼肌中，细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]i）受到严格调控。通过控制[Ca²⁺]i的变化来传递信号，可以驱动特定的肌肉适应性变化，包括肌生成、生长、再生以及肌肉收缩的控制（Gehlert等人，2015；Stradling，1989）。相反，参与Ca²⁺处理的蛋白质功能障碍与肌肉疾病的发展有关，如肌强直、肌肉无力、麻痹和肌肉萎缩（Allard，2018；Treves等人，2005）。在骨骼肌细胞中，细胞内温度变化（Ikegami等人，2019）和药物刺激（Reggiani，2021；Truong等人，2019）可以直接影响[Ca²⁺]i的稳态。已知急性冷却或咖啡因可以在体外诱导两栖动物骨骼肌的收缩（Axelsson和Thesleff，1958；Sakai，1986）。这种现象是通过非动作电位途径增加[Ca²⁺]i来实现的（Kurihara等人，1984）。我们之前使用体内啮齿动物模型的研究证实了冷却诱导的[Ca²⁺]i增加与肌肉收缩之间的关系（Takagi等人，2021b）。冷却影响肌浆网的整体Ca²⁺处理能力，从而增加净Ca²⁺释放并提高[Ca²⁺]i水平（Takagi等人，2021a；Takagi等人，2021b），而咖啡因则直接影响Ryanodine受体，这是一种肌浆网钙释放通道（des Georges等人，2016）。此外，至少在雄性大鼠肌肉中，咖啡因和冷却刺激具有协同效应；咖啡因通过提高触发阈值扩大了冷却诱导[Ca²⁺]i增加的温度范围（Takagi等人，2021b）。

最近对雄性大鼠肌肉的研究表明，长期冷却刺激导致的[Ca²⁺]i增加激活了蛋白质合成途径，从而引起肌纤维肥大和增殖（Takagi等人，2023）。这些结果为冷却对肌纤维适应性的影响提供了新的见解。然而，雄性大鼠对冷却刺激的适应性可能受性别和肌纤维类型的影响，因此可能不适用于雌性或肌纤维类型不同的肌肉（例如，主要是慢肌或快肌）。多项研究探讨了Ca²⁺处理的性别和肌纤维类型特异性差异。例如，与雄性相比，雌性啮齿动物的慢肌纤维具有更强的钙缓冲能力，因此在剧烈离心收缩后不太容易积累[Ca²⁺；此外，雌性的快肌力量恢复更快（Sonobe等人，2010；Watanabe等人，2020；Watanabe等人，2021）。因此，雌性更强的[Ca²⁺缓冲能力可能抑制冷却和咖啡因引起的[Ca²⁺短暂升高，从而使得这些治疗方法在促进雌性肌肉肥大方面的效果不如雄性。然而，咖啡因诱导的、对Ryanodine敏感的钙释放系统在性别和肌纤维类型上的差异尚未明确。

本研究的目的是利用体内模型来探讨C57BL/6J小鼠的比目鱼肌（主要是慢肌）和比目鱼肌（主要是快肌）中[Ca²⁺稳态以及对冷却和咖啡因负荷的响应的性别和肌纤维类型依赖性差异。具体来说，我们测试了这样一个假设：与雄性相比，雌性小鼠的慢肌和快肌在冷却和咖啡因刺激下的[Ca²⁺升高幅度会降低。

动物

C57BL/6J小鼠（总数42只；日本静冈SLC）被饲养在控制温度（25°C）和12:12光照周期的环境中，可自由摄取标准饲料（5L37；PMI Nutrition International，日本静冈SLC）和水。小鼠被分为两个独立的实验组：体内生物成像组（共9只雄性和11只雌性，13–15周龄）和Western blot分析组（共11只雄性和11只雌性，16周龄）。所有体内实验

冷却刺激条件下的[Ca²⁺]i动态

如图2所示，冷却刺激在雄性和雌性小鼠中均显著增加了细胞内Ca²⁺浓度（[Ca²⁺i）。然而，在比目鱼肌（PLA）或比目鱼肌（SOL）中，这种[Ca²⁺i]增加的幅度在性别上没有显著差异（图2B）。SOL肌肉中[Ca²⁺i]积累的温度阈值显著高于PLA肌肉。尽管如此，性别之间没有显著差异

讨论

本研究在体内啮齿动物模型中探讨了冷却和咖啡因刺激期间[Ca²⁺i]动态的性别和肌纤维类型特异性差异。主要发现如下：（1）冷却诱导的[Ca²⁺i]积累的温度阈值在慢肌SOL中高于快肌PLA，且性别之间无差异。（2）高浓度（80 mM）咖啡因刺激在雌性中的[Ca²⁺i]积累量大于雄性。（3）当冷却与

结论

与我们的假设相反，本研究并未发现冷却过程中细胞内Ca²⁺动态在快肌（PLA）或慢肌（SOL）中存在性别差异。相反，寒冷与低浓度（1.25 mM）咖啡因的相互作用显著增强了雌性小鼠的[Ca²⁺i]升高，而雄性小鼠则没有这种效应。此外，仅咖啡因刺激的效果在性别之间也存在差异

CRediT作者贡献声明

田口彩香：可视化、方法学、研究、数据管理。宇川春香：可视化、数据管理。林川康诚：撰写初稿、方法学、研究、数据管理、概念构建。高木亮：撰写初稿、方法学、数据管理、概念构建。大卫·C·普尔：撰写与编辑、撰写初稿、可视化、概念构建。金野雄隆：撰写与编辑、撰写初稿、可视化、项目规划

未引用参考文献

des Georges等人，2016。

数据可用性声明

本研究使用的数据可在Mendeley仓库中找到（https://data.mendeley.com/datasets/xfxwd2ck35/2）。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

资助

本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）的KAKENHI资助（编号17K19897、20H04074和24K02827）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突，并且本研究的结果是清晰、诚实地呈现的，没有伪造、篡改或不适当的数据处理。