综述：果实呼吸作用：从不同视角看替代途径

《New Phytologist》：Fruit respiration: putting alternative pathways into perspective

这篇综述深入探讨了果实发育和成熟过程中线粒体替代呼吸途径（Alternative Respiratory Pathways, ARPs）的功能相关性与调控作用，涵盖替代氧化酶（AOX）、解偶联蛋白（UCP）和II型NAD(P)H脱氢酶（NDIIs）等关键组分。文章重新审视了跃变型与非跃变型果实的经典区分，强调了替代呼吸途径在维持代谢灵活性、能量平衡和氧化还原稳态中的核心作用，并讨论了靶向这些途径以改善果实品质、抗逆性和营养价值的采后与代谢工程策略。

　　

在过去的百年里，从生态生理过程到分子机制，研究极大地增进了我们对果实呼吸作用的理解。这篇综述聚焦于线粒体替代呼吸途径在果实生长和成熟过程中的功能相关性与调控角色。我们重新审视了跃变型与非跃变型果实的经典区分，并纳入了关于替代氧化酶、解耦联蛋白和II型NAD(P)H脱氢酶的最新见解。这些组分日益被认为是维持代谢灵活性、能量平衡和氧化还原稳态的核心，支持着初级和次级代谢。

我们强调了CO₂再固定和有机酸代谢（通常表现出类似C₄/景天酸代谢的特征）如何对线粒体电子传递提出特定需求，以及果实不同组织间代谢和氧气可用性的空间异质性如何塑造呼吸活动。果实光合作用与呼吸之间的相互作用，尤其在胁迫条件下，仍然知之甚少。文章讨论了呼吸、乙烯生物合成与信号转导之间的相互作用，强调了涉及线粒体逆行调节和氧化还原敏感的成熟调控反馈回路。关键的知识缺口包括^{in vivo}通量分析、组织分辨的能量谱分析以及尚未充分探索的替代呼吸途径组分的功能表征。最后，我们概述了以替代呼吸途径为靶点的采后和代谢工程策略，作为以乙烯为中心方法的补充，旨在改善果实品质、胁迫韧性和营养价值。

I. 引言

上个世纪初，关于果实成熟和采后生理的研究主要集中于呼吸作用，很少考虑乙烯，这记载于Kidd、West及其同事的经典著作中。直到后来，乙烯才被确定为触发果实成熟的关键气态激素。这一发现将研究转向理解乙烯的合成、感知和作用，乙烯与呼吸一起成为区分跃变型与非跃变型果实的决定性特征。许多综述涉及肉质果实的生物化学和代谢，而专注于呼吸作用的性质和作用的综述大多发表于上世纪，近期只有少数涉及果实成熟过程中的线粒体代谢。在本综述中，我们概述了肉质果实从生长到成熟发育过程中的呼吸代谢，特别强调了替代呼吸途径作用和调控的最新进展。我们还提出了将指导未来研究的关键问题。尽管如此，现有证据已突显了替代呼吸途径在提供代谢灵活性方面的关键作用，使果实能够在整个发育和成熟过程中满足初级和次级代谢途径的能量和碳需求。

植物呼吸是一个基本的代谢过程，它将还原的碳化合物氧化为CO₂和H₂O，释放储存在ATP和还原当量中的能量。除了ATP生产和碳骨架供应，呼吸还维持氧化还原平衡，这一功能对植物的固着生活方式尤为关键。此外，在某些条件下，呼吸可以在生殖组织中产生大量热量，提供额外的生理和进化益处。这些不同的功能需要不同的呼吸通量模式来满足植物细胞和器官的特定需求。由于果实能够合成和积累与胁迫响应和种子传播相关的多种化合物，包括萜类、挥发物和苯丙烷类，因此表现出特别复杂的代谢。此外，CO₂再固定和有机酸代谢显示出类似C₄/景天酸代谢的特征。果实生长和代谢物生物合成依赖于ATP和包括糖、有机酸和氨基酸在内的碳前体，它们的水平受呼吸代谢的严格调节。胞质糖酵解、线粒体三羧酸循环和电子传递链通过替代路线和能量旁路途径的运行显示出显著的代谢灵活性。尽管植物呼吸代谢的组分和途径已得到很好的表征，但其调控仍未完全阐明，特别是在复杂的果实代谢网络背景下。

2再固定为草酰乙酸，随后被苹果酸脱氢酶还原为苹果酸。柠檬酸和苹果酸通过H⁺-ATP酶和H⁺-焦磷酸酶的作用在液泡中积累，这也促进了液泡酸化。内部（异养）组织产生的苹果酸可以运输到外部绿色组织，在那里其被NADP-苹果酸酶脱羧，增加了Rubisco的叶绿体CO₂可用性。抗坏血酸生物合成和相关有机酸途径在早期发育过程中也非常活跃。（b）成熟阶段。液泡有机酸被逐步重新动员，并可以通过糖异生途径生成丙糖磷酸、己糖磷酸和己糖，这些物质要么在液泡中积累，要么有助于氨基酸和下游次级代谢物的合成。这些代谢重排伴随着成熟过程中果实特征从以酸为主到以糖为主的转变。">

II. 果实生长过程中的呼吸作用

关于苹果果实的开创性研究表明，早期果实发育期间的高呼吸作用伴随着强烈的细胞分裂和扩张，随后随着生长减慢，呼吸速率下降。这些发育阶段在肉质果实中是常见的，尽管不同物种的生长速率模式不同。尽管如此，Roch等人发现果实生长速率与结构成分（包括脂质、细胞壁成分和蛋白质）的积累之间存在一致的相关性。在此基础上，Colombié等人使用通量平衡模型揭示了氮代谢在决定果实生长中的关键作用。他们的研究发现了一个复杂的权衡，即由细胞壁合成驱动的快速生长与防御化合物积累减少有关，表明生长优先于防御机制。有趣的是，碳可用性不是限制因素，强调了氮代谢是生长能力的关键决定因素。在这些研究中，使用不同的代谢建模方法已被证明对于探索驱动果实生长和发育的代谢决定因素非常有效，使研究人员能够规避测量^{in vivo}代谢通量的实验挑战。然而，此类模型通常假设植物呼吸的ATP产量高于植物体内的实际值，因为它们很少考虑线粒体电子传递链内能量旁路系统的参与。在此背景下，已提出通过精确操纵非磷酸化的替代氧化酶途径作为一种有前景的策略，通过减少维持呼吸并将能量和碳资源重新分配给生长来提高作物产量。然而，这些建议是基于来自营养组织的数据，估计替代氧化酶呼吸贡献了总呼吸的10-50%。果实呼吸尚未明确纳入这些分析中。确定果实生长过程中，特别是在提高维持成本的胁迫条件下，替代呼吸的^{in vivo}贡献，对于全面理解发育果实中的呼吸控制仍然至关重要。

III. 果实呼吸作用和光合碳同化

果实主要作为库组织，在基于约束的模型中通常被视为如此，碳被假定完全来自韧皮部输入的蔗糖。然而，果实光合作用对整体碳平衡的贡献仍存在争议。来自几种肉质果实的证据表明，碳同化很大程度上依赖于呼吸释放的CO₂的再固定，而通过气孔的外部CO₂吸收是微少的，并且强烈依赖于物种。例如，鳄梨、柑橘和黄瓜的果实表面气孔密度相对较高，表明有外部CO₂吸收的潜力，尽管气孔功能仍不清楚。在番茄中，果实光合作用的遗传损伤不影响果实生长，这可能是由于叶片碳输入的补偿。然而，水分胁迫下番茄果实中光合基因的诱导表明，当叶片同化受损时，果实光合作用可能维持生长。类似地，在其他物种中，果实光合作用对其生长和品质的贡献在非生物胁迫下似乎会增加。

除了在碳平衡中的作用外，果实中呼吸和光合代谢之间的相互作用仍然知之甚少。线粒体代谢支持光合作用、光呼吸、氮代谢、还原力运输和氧化还原平衡，特别是在非最佳条件下的叶片中。三羧酸循环通常以非循环模式运行，为氮代谢和氨基酸合成提供碳前体和还原力。虽然大量研究已经表征了照光叶片和根中三羧酸循环酶的功能，但对其在果实中的作用了解较少。这方面的例外是降低线粒体苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶表达对果实代谢和成熟的相关影响。值得注意的是，有机酸在果实发育中的作用在早期结合番茄代谢物和转录谱的研究中已被提出，后来通过操纵磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和质体NADP-苹果酸酶突出了苹果酸的特定功能。尽管这些研究主要涉及成熟过程中的代谢控制，但它们强调了三羧酸循环和有机酸代谢在果实生长阶段的调控和作用仍然是重要的开放性问题。

2被叶绿体中的Rubisco重新同化，由质体电子传递链产生的ATP和NADPH支持。当光可用性超过叶绿体还原力需求时，多余的还原力通过苹果酸阀门输出到胞质和线粒体。卡尔文循环产生的丙糖磷酸为淀粉、蔗糖、脂肪酸和氨基酸生物合成提供前体。叶绿体丙糖磷酸和其他糖酵解中间体也可以输出到胞质，为呼吸代谢提供燃料。丙酮酸、草酰乙酸和苹果酸构成了连接质体和线粒体途径的关键交换代谢物。在线粒体中，丙酮酸和有机酸通过三羧酸循环被氧化，产生NADH，为线粒体电子传递链提供燃料以产生ATP。柠檬酸、苹果酸、草酰乙酸和2-酮戊二酸在区室间的交换有助于平衡碳骨架供应和氧化还原状态。总体而言，这些细胞器间通量提供了代谢灵活性，并支持早期果实生长和环境波动期间的能量和氧化还原稳态。">

IV. 果实呼吸作用、CO₂再固定和有机酸代谢

碳通量分析揭示了黄瓜光合作用对果实生长的重要贡献，外部CO₂固定有限，但内部再固定广泛，由高呼吸活动驱动。这种再固定主要由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶介导，如在黄瓜、番茄和苹果中所证明的。类似C₄/景天酸代谢的机制在果实中运行，其中由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶产生的胞质苹果酸被运输到绿色组织的叶绿体中，并被NADP-苹果酸酶脱羧以释放CO₂供Rubisco使用。NADP-苹果酸酶还促进黄瓜果实中碳通量进入可溶性糖和淀粉。高磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性与液泡中苹果酸和柠檬酸的积累并行，与离子运输一起，支持细胞扩张和快速果实生长。

最近的综述强调，通过苹果酸相关反应的通量方向在果实发育过程中动态变化。在生长过程中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和NADP-苹果酸酶主要支持回补和CO₂再固定，而在成熟过程中，从液泡释放的有机酸可以通过糖异生回收到糖和氨基酸骨架中。根据Walker等人的研究，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和丙酮酸磷酸二激酶依赖的途径都在果实中运行，它们的相对贡献取决于物种、发育阶段和氮状态。因此，苹果酸和柠檬酸的液泡储存和释放对于协调分解代谢和糖异生通量至关重要，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶和丙酮酸磷酸二激酶形成了一个调控枢纽，在果实生长和成熟过程中连接胞质pH、呼吸和糖代谢。

其他有机酸，特别是酒石酸和草酸，也在早期发育过程中在液泡中积累。在葡萄中，酒石酸来源于抗坏血酸中间体，充当渗透调节剂和碳库，同时在成熟过程中有助于氧化还原和质外体信号传导。草酸也可能协助离子平衡和钙储存，加强了有机酸在果实发育中的多功能性。

除了这些结构功能外，有机酸还发挥调控和信号作用。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、柠檬酸合酶和顺乌头酸酶的协调活动将有机酸周转与糖代谢和呼吸整合在一起。这些途径响应激素和环境信号，脱落酸和乙烯在成熟和胁迫过程中调节苹果酸和柠檬酸水平。此外，苹果酸、柠檬酸和2-酮戊二酸充当代谢信号，影响氧化还原平衡和碳氮相互作用，强调了它们在调节果实生长、成熟和品质中的核心作用。确实，早期一项跨番茄果实成熟的多组学研究强调了这一点，该研究揭示了典型的成熟差异表达基因与三羧酸循环中间体水平的差异高度相关。这一观察结果在随后的转基因实验中得到了机制上的证实。

与此综合观点一致，代谢的空间异质性表明，CO₂再固定、有机酸周转和糖代谢在果实组织间（果皮、心室和维管区域）存在差异，反映了光合能力、呼吸活动和发育之间的不同协调。番茄的代谢组学分析显示外部和内部组织之间的有机酸和糖谱存在显著差异，而建模和机制研究支持内部CO₂再固定和苹果酸介导的穿梭耦合组织层间的光合和呼吸过程。这种区室化的通量可能优化了发育果实的内部碳经济和氧化还原稳态，表明不同的组织可能差异性地利用线粒体电子传递链内的替代呼吸途径来满足其特定的代谢需求。

V. 果实呼吸作用和线粒体电子传递链

线粒体电子传递链对于植物通过线粒体内膜上的氧化磷酸化产生能量至关重要。同时，植物线粒体电子传递链的特点是其替代呼吸途径，包括内部和外部II型NAD(P)H脱氢酶、解耦联蛋白和替代氧化酶。尽管这些途径不与ATP合成偶联，但大量证据支持它们在提供细胞代谢灵活性同时避免活性氧和活性氮物质形成方面的重要作用。解耦联蛋白耗散质子梯度，从而使电子传递与ATP合成解耦。^{in vitro}研究提出拟南芥UCP1和2作为代谢物转运蛋白的额外作用，可能在光呼吸期间促进细胞区室间的氧化还原代谢物交换。虽然Sweetlove等人的研究提供了UCP1在光呼吸中作用的^{in vivo}证据，但其作为解耦联蛋白与代谢物转运蛋白的双重操作的相对重要性仍未解决。这个问题在果实中尤其未得到探索。另一方面，II型NAD(P)H脱氢酶和替代氧化酶允许电子传递而不产生质子梯度。几种II型NAD(P)H脱氢酶将电子从NAD(P)H转移到泛醌池，绕过了复合体I的质子泵。这些包括位于线粒体内膜基质侧的内部II型NAD(P)H脱氢酶，和位于内膜膜间隙侧的外部II型NAD(P)H脱氢酶。尽管它们的性质和调控在拟南芥中得到了很好的表征，但它们在肉质果实中的作用仍然很大程度上未知。最后，替代氧化酶蛋白插入植物线粒体的内膜，并在泛醌池水平分支细胞色素^c氧化酶途径，绕过了复合体III和IV的质子易位。总的来说，替代呼吸途径作为改善非生物和生物胁迫下作物性能的潜在靶点已经受到关注，但它们在如果实等非光合库组织中的作用仍未得到充分研究。此外，线粒体电子传递链通过充当高光或铵胁迫下叶绿体过量还原力的库来促进光合性能。几个物种果实的叶绿素荧光测量表明，早期果实发育过程中存在功能性的电子传递链，在葡萄中响应高光强度。在此类条件下，替代呼吸途径的动态激活增强了代谢灵活性，平衡了碳和能量的供应与需求。尽管替代呼吸途径在果实胁迫响应中的作用仍然知之甚少，但可以合理地假设这些在叶片中已得到很好表征的途径在果实初级代谢中也扮演重要角色。

2的电子通过四个主要多亚基复合体传递：复合体I、复合体II、复合体III和复合体IV。当电子流经复合体I、III和IV时，质子从线粒体基质易位到膜间隙，产生电化学质子梯度。这个梯度通过质子动力驱动复合体V催化ATP合成。这种电子传递偶联的ATP合成系统使得电子传递链能够被ADP和Pi可用性以及细胞的能量需求紧密调控。（b）替代呼吸途径由几种替代蛋白组成，包括II型NAD(P)H脱氢酶、替代氧化酶和解耦联蛋白，它们可以绕过典型链的部分。替代氧化酶途径允许电子从泛醇直接转移到分子氧，将其还原为水，而不有助于质子梯度形成。替代氧化酶绕过了复合体III和IV的质子泵活动。虽然通过复合体I仍然可以产生一些ATP，但从替代NAD(P)H脱氢酶或复合体II到替代氧化酶的电子传递完全与ATP合成解耦。替代氧化酶由一个多基因家族编码，包含AOX1和AOX2型基因，其中一些显示出不同的器官和发育表达模式。大多数植物替代氧化酶已被发现处于二聚体状态，可以通过二硫键/巯基系统进行氧化还原调节，但有一些例外。一旦其二硫键被还原，替代氧化酶活性可以通过与有机酸（如丙酮酸）相互作用的变构调节被刺激，这已在分离的线粒体或其他^{in vitro}系统中得到证明。然而，替代氧化酶在^{in vivo}中被变构激活的程度仍不确定，可能取决于亚型特异性激活特性和替代氧化酶同源和异源二聚体的共存。另一方面，解耦联蛋白可以通过促进质子重新进入基质来耗散质子梯度，从而即使在细胞色素c氧化酶途径活跃时也使电子传递与ATP解耦。先前，在拟南芥中发现了一个包含六个成员的解耦联蛋白亚家族，尽管后来大多数成员被重命名为二羧酸载体。解耦联蛋白被嘌呤核苷酸直接抑制，并被游离脂肪酸或脂质过氧化产物如4-羟基-2-壬烯醛激活，后者是强烈的替代氧化酶抑制剂。这种^{in vitro}证据支持了一个模型，其中替代氧化酶和解耦联蛋白在升高的线粒体活性氧水平下顺序作用；然而，证实这种替代氧化酶/解耦联蛋白协调作用的^{in vivo}证据，以及确定其运作的生理环境，比如果实成熟，仍有待建立。">

线粒体在维持细胞氧化还原平衡方面的另一个重要作用是线粒体电子传递链参与抗坏血酸的合成。抗坏血酸合成的最后一步由L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶催化，位于内膜并使用氧化的细胞色素c作为电子受体。Matos等人提出，替代氧化酶活性可能通过调节线粒体电子传递链的氧化还原状态来影响抗坏血酸合成，特别是在胁迫下，尽管缺乏^{in vivo}证实。尽管抗坏血酸在果实代谢和成熟中很重要，但这种关系最近才在分离的木瓜线粒体中得到检验。在L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶或替代呼吸途径修饰的果实中测量替代氧化酶和细胞色素c氧化酶途径之间的^{in vivo}电子分配，可以为线粒体对抗坏血酸合成的控制提供关键见解。Decros等人最近发现，抗坏血酸合成的增加与番茄果实早期发育阶段的生长密切相关，尽管抗坏血酸主要以氧化形式存在。从细胞分裂到扩张的转变伴随着从氧化态到还原态抗坏血酸的急剧转变。这些结果共同表明了生长与氧化还原代谢之间的紧密联系。在不同物种中，高水平的氧化态抗坏血酸是果实发育开始的特征，非跃变型果实在整个过程中维持更氧化的状态。有趣的是，Roch等人提出，生长阶段积累的化合物的性质和丰度可能影响成熟的跃变特性。与呼吸和乙烯合成紧密相关的成熟将在以下部分进一步探讨。

VI. 跃变型和非跃变型果实成熟

成熟过程发生在果实发育的最后阶段，决定了果实品质，因为发生了许多影响外观和营养价值的生理生化变化。这些包括香气产生、软化、糖、有机酸和维生素的积累，以及它们的抗氧化潜力变化等。已经进行了许多研究以了解果实成熟的生理、遗传、表观遗传和代谢因素。根据它们的成熟行为，肉质果实可分为跃变型或非跃变型。在跃变型果实如番茄、香蕉、苹果、梨或鳄梨中，成熟的启动与乙烯产生的峰值和呼吸的爆发有关，这触发了主要的转录组和代谢重组。相比之下，非跃变型果实如草莓、葡萄、樱桃或柑橘在成熟过程中不显示乙烯峰值或呼吸增加。相反，其他激素如脱落酸、油菜素内酯或茉莉酸协调成熟过程。最近，这种二元分类受到挑战，因为存在各种各样的果实，在成熟过程中具有不同水平的乙烯产生和呼吸模式，突显了该过程的复杂性。其中，甜瓜已成为研究果实成熟的替代模型，因为跃变型和非跃变型品种在该物种中共存。基因编辑工具和高灵敏度乙烯检测方法在甜瓜中的可用性，加上最近在果实组织中O₂消耗测量的进展，现在使该物种成为解析成熟遗传和调控机制以及完善跃变型和非跃变型行为区分的优秀模型。

VII. 当前果实模型中的乙烯生物合成和调控

果实生物学的一个核心问题是什么触发了跃变型成熟的开始。乙烯作为控制这一过程的主要激素，其生物合成、感知和信号通路在番茄（跃变型成熟的模型物种）中得到了广泛研究。乙烯生物合成始于甲硫氨酸。除了作为其前体外，甲硫氨酸还参与各种需要低但稳定的细胞水平的生理过程。杨氏循环合成并再循环甲硫氨酸及其衍生物S-腺苷甲硫氨酸。在跃变型成熟期间，杨氏循环基因高度表达，确保从5'-甲硫腺苷再循环甲硫氨酸。杨氏循环和乙烯生物合成的这种协调调控有助于控制成熟进程并延迟衰老。跃变型果实表现出两种不同的乙烯产生系统。系统-1在跃变型和非跃变型果实以及营养组织中维持基础的、自我抑制的乙烯水平。相比之下，系统-2在成熟过程中驱动大量乙烯产生，水平通过自动催化调控增加高达300倍。从系统-1到系统-2的转变发生在果实成熟开始时，但其潜在机制仍不清楚。

乙烯生物合成的关键酶，1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，由多基因家族编码，它们在果实生长和成熟中的作用已得到广泛研究。在番茄中，参与系统-1的SlACS1和SlACS6被乙烯负调控，而SlACS2和SlACS4在果实成熟期间在系统-2中起主要作用，并通过乙烯的正反馈上调。SlACO1和SlACO4在果实生长期间以低水平表达，但在跃变型成熟开始时随着乙烯水平升高而被诱导。

存在多种番茄自发性成熟相关突变体，包括^{ripening-inhibitor}、^nonripening或^{colorless nonripening}，它们影响成熟的启动，以及^Never-ripe和^Green-ripe，它们在乙烯感知和/或信号传导方面受损。这些突变体使得能够鉴定许多参与调控乙烯生物合成、感知和信号通路的转录因子和基因。其中，三个已成为关键的主调控因子：RIN（一种SEPALLATA MADS-box转录因子）、CNR（一种SQUAMOSA启动子结合蛋白）和NOR（一种NAC转录因子）。乙烯感知通过膜结合乙烯受体发生，它们作为负调控因子。在没有乙烯的情况下，活化的乙烯受体抑制激素的信号通路，阻止下游反应的激活。然而，当乙烯与乙烯受体结合时，组成型三重反应蛋白被失活。这